慢性低劑量LPS刺激對大鼠腦內黑質部小膠質細胞和多巴胺神經元的影響

任占秀 曹 丹 高 超 羅曉光 任 艷 何志義

(中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧 沈陽 110001)

近年來，越來越多的研究者認為腦內炎癥引起小膠質細胞的免疫反應可能是帕金森病(PD)發病機制的一個重要因素〔1〕。日常生活中，人們會遇到各種體內體外的有害刺激，這種外周的刺激會對中樞免疫系統產生影響〔2〕，使之激活。雖然每一次有害刺激不都是致病性的，但在反復多次非致病性有害刺激下，有可能會積累造成腦內免疫環境的改變，導致或促進了腦內慢性炎癥過程，成為PD發病的基礎〔3〕。既往的PD炎癥動物模型研究，大多向黑質內單次注入致病劑量(＞2 μg)的LPS〔4〕，模擬的是腦內急性炎癥反應過程，不能真正反映PD的慢性炎癥的病變環境。本實驗向黑質內反復多次注入亞損傷劑量的LPS，力圖以更接近PD自然病程的方式模擬腦內反復慢性炎癥的過程，觀察其對腦內慢性炎癥環境形成的作用，以及對小膠質細胞形態和功能及多巴胺神經元存活的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制作

1.1.1 實驗材料及試劑 大鼠腦立體定位儀(日本NARISHIGE 公司，型號:SN-3)，LPS(Sigma)，PBS(Sigma)，10% 水合氯醛。健康雄性SD大鼠兩月齡 (體重200～250 g)(由中國醫科大學動物部提供)30只。酪氨酸羥化酶(TH)抗體:Cell Signaling#2792，小膠質細胞(Iba1)抗體:日本 Roth公司 Code No.019-19741;SP試劑盒，福州邁新，大鼠抗兔/鼠。大鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒:博士德公司，武漢。

1.1.2 實驗過程 30只SD大鼠隨機分為LPS一次注射組、PBS四次注射組和LPS四次注射組。LPS一次注射組大鼠右側黑質部注入 0.5 μg(0.25 μg/μl)LPS，LPS 四次注射組大鼠腦右側黑質部注入 0.5 μg(0.25 μg/μl)LPS，PBS 四次注射組大鼠腦右側黑質部注入等體積PBS，后兩組每月注射一次，共注射四次。每只大鼠分別以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。以前囟為標志確定黑質SN給藥點的三維坐標圖，即前囟后4.4 mm，中線右旁1.2 mm，硬腦膜下7.8 mm。將0.5 μg LPS或者2 μl PBS在10 min內緩慢注入黑質部，留針5 min后緩慢退出注射器。在每組最后一次注射后一個月，心臟灌流后固定取材。

1.2 切片制作及免疫組化染色 10%水合氯醛腹腔注射麻醉。左心室多聚甲醛灌流，迅速取腦，隨后多聚甲醛后固定，二甲苯透明，包蠟，進行4 μm連續切片。染色時對照大鼠解剖圖譜取包含黑質部位切片。每隔5張取一張片子，每組各取10張。常規脫水后，先經3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶活性，繼之用高壓鍋法3 min抗原修復，自然晾涼至室溫，山羊血清封閉15 min，棄去血清不洗。直接加TH一抗(1∶200)或Iba1一抗(1∶200)4℃過夜，二抗用大鼠抗兔/鼠SP試劑盒，TH用DAB顯棕黃色，顯微鏡下控制顯色時間，去離子水終止反應。中性樹脂封片，Iba1用AEC顯紅色，直接水性封片劑封片。顯微鏡下觀察。

ELISA法檢測各組大鼠腦黑質部TNF-α、IL-1β炎癥介質含量。動物處死后，迅速分離出大鼠左右腦黑質部，冰上操作，生理鹽水沖去血液，放入EP管中，眼科剪子剪碎，勻漿器勻漿，分別按照TNF-α、IL-1β的ELISA試劑盒說明，在抗體包被的96孔板中分別加入倍比稀釋的標準蛋白和待測樣品，置于4℃搖床過夜，以試劑盒帶的洗滌液洗滌，加入一抗，37℃ 2 h，洗滌，再加入HRP二抗，洗滌后TMB顯色，以96孔酶標計數儀檢測光密度值。

1.3 細胞計數 首先檢查切片的對稱性，切片左右不對稱的大鼠切片不用于細胞計數，每只大鼠隨機取包含黑質的中腦切片5張，在40倍顯微鏡下計數兩側黑質有完整細胞體的TH陽性細胞，計算各組與LPS一次注射組黑質TH陽性細胞數的百分比(各組黑質TH陽性細胞數/LPS一次注射組黑質TH陽性細胞數×100%)，最后5張切片進行平均。同時在400倍顯微鏡下觀察小膠質細胞形態。根據其形態分為3期:靜止期(小細胞體，許多細小突起)，激活期(細胞體變大，短粗突起)，活化期(偽足或圓形細胞體無突起)。每張切片均由3人采用盲法進行計數。

2 結果

2.1 小膠質細胞形態學改變 見圖1。

圖1 各組黑質部小膠質細胞形態學改變(AEC顯色，Iba1一抗1∶200)

2.2 各組多巴胺神經元生長情況 見圖2。LPS一次注射組，多巴胺神經元分布形態完整，數量無減少，TH計數為186.4±3.7;PBS四次注射組，多巴胺神經元數量少量減少，TH計數為152.7±3.9，與LPS一次注射組的比值為81.9%，二組間比較無顯著差異(P＞0.05);LPS四次注射組多巴胺神經元數量顯著減少，TH計數為95.5±6.9，與LPS一次注射組的比值為51.2%，二組間比較差異顯著(P＜0.05)。

2.3 ELISA檢測結果 見圖3。與LPS一次注射組相比，PBS四次注射組TNF-α、IL-1β含量略增加，但差異無統計學意義(P＞0.05);LPS四次注射組TNF-α、IL-1β含量相對于LPS一次注射組及PBS四次注射組明顯增多(P＜0.05)。

圖2 各組右腦黑質部多巴胺神經元免疫組化染色DAB顯色(×40，TH 一抗1∶200)

圖3 各組黑質部炎性因子含量變化情況(ELISA法)

3 討論

本文僅一次注入低劑量(0.5 μg)LPS后，黑質部小膠質細胞在一個月后呈正常靜止狀態，多巴胺神經元數量也沒有減少，可見此劑量的LPS對小膠質細胞的功能形態及多巴胺神經元存活和腦內炎癥環境沒有太大影響。說明0.5 μg LPS對于本實驗是一種亞損傷劑量。但在LPS四次注射組，炎性因子釋放增多，提示腦內形成炎性環境，小膠質細胞形態發生明顯改變，多巴胺神經元數量減少，說明反復多次注入低劑量LPS能夠導致腦內慢性炎性環境，積累刺激使小膠質細胞形態及功能均發生改變，對多巴胺神經元產生毒害作用。

本實驗中LPS四次注射組小膠質細胞形態學異常改變，符合功能障礙或老化小膠質細胞的特征〔5〕，功能障礙的小膠質細胞在退行性疾病進程中的作用已被許多證據證明〔6〕。因此我們推測，在本實驗中，是這種形態異常的小膠質細胞參與了TH神經元的死亡。

已有實驗證實大鼠腦內注射非致病劑量LPS不會對多巴胺神經元產生損害作用，但是可以增加多巴胺神經元變性的敏感性〔7〕，小膠質細胞的反復激活，會使小膠質細胞的端粒酶消耗，最終導致小膠質細胞衰老，產生功能障礙，發揮有害作用，使敏感的多巴胺神經元死亡。由于小膠質細胞對外界環境異常敏感，因此PBS四次注射組實際上模擬了四次機械性刺激，結果小膠質細胞形態學未見明顯變化，多巴胺神經元數量相對于LPS一次注射組少量減少，炎性因子少量增加，雖然無統計學意義，但也從側面說明非致病性刺激反復激活小膠質細胞，會導致小膠質細胞形態及功能發生改變。

小膠質細胞的激活主要產生兩種神經炎性因子:TNF-α，IL-1β。TNF-α是炎癥反應的啟動物質，其釋放失控，將產生更多炎癥介質，并相互作用，形成炎性因子網絡，參與機體炎癥反應，使致炎因子與抗炎因子之間的平衡失調，炎癥反應過度，實驗表明腦內TNF-α表達增加對多巴胺神經元產生損害作用，而抑制TNF-α則對多巴胺神經元有保護作用〔8〕。IL-1β在炎癥反應及其他疾病中，對生理和病理起著重要的調節作用，激活的小膠質細胞釋放IL-1β介導細胞毒性作用促進神經元的慢性變性壞死。本實驗中LPS四次注射組這兩種炎性因子均增高，表明小膠質細胞異常激活對多巴胺神經元產生有害作用，異常釋放的炎性因子發揮了重要作用。

1 Nehe R.Primary phagocytosis of neurons by inflammed microglia:potential roles in neurodegeneration〔J〕.Neuropharmacology，2012;27(1):1-9.

2 Liya Q.Systemic LPS causes chronic neuroinflammation and progressive neurodegeneration〔J〕.Glia，2007;55(5):453-62.

3Hernao¨ndez-Romero MC.Peripheral inflammation increases the deleterious effect of CNS inflammation on the nigrostriatal dopaminergic system〔J〕.Neurotoxicology，2012;33(3):347-60.

4 王普清，孫圣剛.黑質內注射脂多糖對多巴胺能神經元和小膠質細胞活性的影響〔J〕.中國康復，2008;23(6):380-1.

5 Streit WJ.Life and death of microglia〔J〕.Neuroimmun Pharmacol，2009;4(2):371-9.

6 Streit WJ.Dystrophic(senescent)rather than activated microglial cells are associated with tau pathology and likely precede neurodegeneration in Alzheimer's disease〔J〕.Acta Neuropathol，2009;118(3):475-85.

7 Koprich JB，Reske-Nielsen C.Neuroinflammation mediated by IL-1β increases susceptibility of dopamine neurons to degeneration in an animal model of Parkinson's disease〔J〕.J Neuroinflamm，2008;5(1):8-15.

8 Carta AR，Frau L.Rosiglitazone decreases peroxisome proliferator receptor-gamma levels in microglia and inhibits TNF-alpha production:new evidences on neuroprotection in a progressive Parkinson's disease model〔J〕.Neuroscience，2011;194(2):250-61.