兒茶素對(duì)放射性損傷大鼠肺組織TNF－α表達(dá)水平的影響

石衛(wèi)民 高 蕾 陳龍華 宋維舒 (南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科，廣東 廣州 5055)

兒茶素，分子式C15H14O6，存在于茶葉、蘋果、葡萄、紅酒和可可等膳食中，包括4種單體成分:表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)和表兒茶素(EC)，具有抗衰老、抑制炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用〔1～4〕。有研究發(fā)現(xiàn)其單體及混合體對(duì)不同組織具有不同程度的輻射防護(hù)作用，其研究見于外周血淋巴細(xì)胞、小腸絨毛細(xì)胞等〔5～8〕，而目前尚未見對(duì)于放射性肺損傷的研究。本實(shí)驗(yàn)擬研究?jī)翰杷鼗旌象w對(duì)放射性肺損傷的影響和對(duì)照射后肺組織TNF－α表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雌性Wistar大鼠，購自廣州省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重(200±20)g。供試前在SPF級(jí)清潔動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)3 d，觀察無異常者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2 茶兒茶素混合品 兒茶素混合體(主要EGCG 50%～60%，EGC 30%，余為ECG和EC)購自廣東省中藥研究所，純度95%以上。

1.3 照射條件 使用美國瓦里安公司的VARIAN 2300C直線加速器(廣州中醫(yī)藥大學(xué)廣東省中醫(yī)院放療科)產(chǎn)生的6 mV X線。照射時(shí)大鼠清醒狀態(tài)俯臥于體模固定板上，用瓦里安直線加速器6 mV X射線等距離照射全肺，照射野上界平大鼠腋窩，下界平胸骨劍突，左、右至胸廊外側(cè)，大鼠全身其余部分用擋鉛屏蔽。源皮距為 100 cm，計(jì)算點(diǎn)深度為 2 cm，劑量率為320 cGy/min，一次性照射劑量為15 Gy。

1.4 方法 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。兒茶素+照射組動(dòng)物每日予兒茶素，100 mg/kg腹腔注射，從照射前一天開始，直至照射后第6天，共7 d;單純兒茶素組100 mg/kg腹腔注射7 d。空白對(duì)照組及單純照射組每日腹腔注射生理鹽水20 ml/kg。實(shí)施照射后2 w、6 w，各組動(dòng)物隨機(jī)取5只，處死后分別取肺組織在10%中性甲醛緩沖液中固定準(zhǔn)備制作病理蠟塊。①HE染色光鏡觀察:由病理科醫(yī)生在顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化(盲法)。②肺組織TNF－α蛋白免疫組化染色檢測(cè):一抗為abcan生物技術(shù)公司兔抗鼠多克隆抗體，抗體工作濃度為1∶2 000;二抗為福州邁新公司通用試劑盒，按試劑盒說明書操作。每張切片在400倍視野下選取10個(gè)有代表性、無重疊、不連續(xù)視野，盲法計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，取平均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組動(dòng)物TNF－α染色陽性的細(xì)胞數(shù)比較用t檢驗(yàn)，用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀 大鼠肺照射2、6 w后，解剖肉眼可見單純照射組小鼠的肺組織表面明顯點(diǎn)片狀充血，出血病灶，而在照射+兒茶素組的肺組織僅呈充血狀，未見明顯出血病灶。

2.2 組織學(xué)結(jié)果 單純照射組動(dòng)物肺損傷較重，包括肺泡內(nèi)出血，肺泡、支氣管上皮、血管的改變，血管周圍水腫較明顯;特別是在單純照射組動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)由于肺泡出血引起肺實(shí)質(zhì)灶性實(shí)變和肺泡上皮水腫;相比之下，照射+兒茶素組動(dòng)物的肺泡間隔增厚、上皮細(xì)胞損傷、血管改變的程度都較單純照射組減輕。見圖1。

2.3 免疫組化結(jié)果 ①鏡下觀:空白對(duì)照組和單純兒茶素組，在其支氣管上皮中TNF－α呈不均一表達(dá)，在肺實(shí)質(zhì)中少量肺泡巨噬細(xì)胞呈陽性表達(dá)，而血管內(nèi)皮和肌層均呈陰性。單純照射組和照射+兒茶素組大鼠，2 w即可見肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型肺泡細(xì)胞呈陽性表達(dá)，肺實(shí)質(zhì)中有大量陽性巨噬細(xì)胞聚集在血管外膜周圍，照射后6 w時(shí)整個(gè)肺實(shí)質(zhì)布滿大量陽性巨噬細(xì)胞。②陽性細(xì)胞計(jì)數(shù):空白對(duì)照組和單純兒茶素組陽性細(xì)胞數(shù)相對(duì)較低，為(18±4)及(20±8)個(gè)，照射后2 w時(shí)單純照射組的陽性細(xì)胞數(shù)為(96±21)個(gè)，較上述兩組明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);照射+兒茶素組的細(xì)胞數(shù)為(38±14)個(gè)，顯著低于單純照射組(P＜0.01)。照射后6 w時(shí)單純照射組的陽性細(xì)胞數(shù)為(79±16)個(gè)，照射+兒茶素組的細(xì)胞數(shù)為(26±14)個(gè)，仍然顯著低于單純照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠肺組織組織學(xué)改變(HE，×100)

圖2 各組大鼠肺組織TNF-α表達(dá)(×200)

3 討論

電離輻射作用于生物機(jī)體時(shí)，最初的事件就是通過直接作用使組織產(chǎn)生DNA損傷或通過間接作用產(chǎn)生自由基(包括OH－，O－2等)，自由基作用于細(xì)胞成分(如膜、胞漿體和DNA等)，細(xì)胞成分損傷的信號(hào)啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子的表達(dá)，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡、增殖或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白產(chǎn)生等事件，產(chǎn)生臨床輻射損傷。研究證實(shí)，兒茶素清除機(jī)體過量自由基的作用對(duì)染色體具有保護(hù)作用。Nair等〔8〕以EC處理大鼠1 h后全身照射γ射線4 Gy，用堿性彗星分析法測(cè)定其外周血淋巴細(xì)胞的DNA鏈斷裂情況，發(fā)現(xiàn)EC減輕了外周血淋巴細(xì)胞的DNA損傷。Yamamoto〔5〕把正常人唾液腺上皮細(xì)胞和口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞用EGCG處理后再用γ射線照射，用MTT法和5－溴脫氧尿核苷核素?fù)饺敕z測(cè)，發(fā)現(xiàn)EGCG對(duì)于正常人唾液腺上皮細(xì)胞的輻射損傷具有防護(hù)效果。Matuo〔9〕用MTT法研究茶水提取物處理后巨噬細(xì)胞進(jìn)行照射的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)巨噬細(xì)胞有輻射保護(hù)作用。高能射線所致的生物效應(yīng)有2/3是因間接作用而發(fā)揮作用，因此兒茶素的自由基清除作用使其有可能發(fā)展成為一個(gè)好的輻射防護(hù)劑，但是目前對(duì)于兒茶素輻射防護(hù)的體內(nèi)研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠肺單劑量照射15 Gy后2 w出現(xiàn)肺組織嚴(yán)重充血、滲出和水腫，而經(jīng)兒茶素處理后再進(jìn)行照射的大鼠肺組織肺泡間隔和間質(zhì)水腫有效減輕。Lee等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)四種兒茶素單體都對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有輻射防護(hù)作用，而四種單體混合物的放射防護(hù)作用強(qiáng)過任何一種單體。

放射性肺損傷，包括早期放射性肺炎和晚期放射性肺纖維化，是胸部腫瘤放療、骨髓移植預(yù)處理的常見并發(fā)癥，是一個(gè)有多種細(xì)胞參與、多種細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜過程。當(dāng)肺臟受到照射后，分泌介導(dǎo)放射性肺損傷發(fā)生的細(xì)胞因子，包括TNF－α、IL－1α、IL－1β、IL－4、MCP－1 以及 TGF－β、PDGF、IGF－1、bFGF 等，介導(dǎo)了后一系列損傷事件發(fā)生，產(chǎn)生病理組織學(xué)改變〔10〕。TNF－α是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)因子，介導(dǎo)損傷后起初的炎性反應(yīng)，如改變血管內(nèi)皮的通透性，增加血管滲出，刺激中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的趨化反應(yīng)，加強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能;同時(shí)，TNF－α還具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)及刺激 IL－1、IL－6等其他細(xì)胞因子釋放的作用〔11，12〕。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肺單劑量照射15 Gy后2 w肺組織中TNF－α即明顯升高，直到照射后6 w繼續(xù)升高，而兒茶素+照射組的大鼠肺組織中TNF－α較照射組減低，說明兒茶素可能通過下調(diào)TNF－α的表達(dá)減輕了放射性肺炎的程度。

本研究證實(shí)兒茶素對(duì)大鼠照射肺有一定保護(hù)作用，可能由于其自由基的清除作用，減少了受照射組織的DNA損傷，從而通過降低肺組織TNF－α的分泌而減少了放射性肺損傷，是否有其他細(xì)胞因子分泌的改變尚不清楚，各種兒茶素單體對(duì)大鼠肺組織的放射防護(hù)情況也有待進(jìn)一步研究。

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