樺褐孔菌的不同提取物對(duì)胃癌BGC－823細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用的體外觀察

崔 濤 鐘秀宏 楊淑艷 趙麗微 關(guān)曉輝 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 吉林 320)

樺褐孔菌屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，學(xué)名:Fuscoporia obliqua(Pers.Fr.)Aoshi或 Inonotus obliquus(Fr.)Pilat，俄語(yǔ)名為:Chaga〔1〕。16 世紀(jì)至今，東歐一些國(guó)家的民間就用這種菌的菌核來(lái)防治癌癥、心臟病、肝病、胃病等。近年來(lái)樺褐孔菌引起俄羅斯、北歐、日本、美國(guó)及韓國(guó)等國(guó)家的相關(guān)學(xué)者的重視，已經(jīng)分離出栓菌酸、三萜類化合物、類固醇、樺褐孔菌醇等成分，有報(bào)道樺褐孔菌提取物對(duì)胃癌 MGC-803、結(jié)腸癌 SNU-484、宮頸癌 HelaS3、肺癌 A549和人類乳腺癌MCF-7等腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡〔2，3〕。本研究利用MTT比色法，比較不同提取方法獲得的樺褐孔菌提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用，為提取分離樺褐孔菌中高效抗胃癌有效單體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 樺褐孔菌水提取物由延邊圣霖菌業(yè)有限公司提供，石油醚提取物(醚提取物)、乙酸乙酯提取物(酯提取物)由延邊大學(xué)藥學(xué)院提供。人胃癌細(xì)胞株BGC-823購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。無(wú)支原體胎牛血清、噻唑藍(lán)(MTT)為北京華美公司產(chǎn)品。RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。二甲基亞砜(DMSO)為江蘇鴻聲化工廠產(chǎn)品。胰蛋白酶(Tripsin)為Difco公司產(chǎn)品。

1.2 樺褐孔菌提取液的制備 取樺褐孔菌1.28 kg，粉碎，用95%乙醇回流提取，減壓回收溶劑，得到醇提取物57 g。殘?jiān)M(jìn)行水煎煮，煎煮液加乙醇放置產(chǎn)生大量沉淀，抽濾后濾液再加95%乙醇使含醇量達(dá)80%，過(guò)濾、沉淀、低溫干燥后得到粗制多糖，再溶解于水進(jìn)行乙醇反復(fù)醇沉，沉淀用丙酮洗滌抽濾干燥得到精制多糖。

醇提取物中加水使其充分分散后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分別得到石油醚萃取物3.10 g和乙酸乙酯萃取物29.40 g。乙酸乙酯萃取物反復(fù)進(jìn)行常壓硅膠柱層析分離，分別用石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇進(jìn)行梯度洗脫分離，重結(jié)晶得到化合物Ⅰ和化合物Ⅱ;給石油醚萃取物反復(fù)進(jìn)行常壓硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫分離，重結(jié)晶得到化合物Ⅲ，三個(gè)化合物均屬羊毛甾烷醇的三萜類化合物〔4〕。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，另加青、鏈霉素各100 kU/L，置于37℃ 、5%二氧化碳及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，于實(shí)驗(yàn)前24 h半量換液，用0.4%苔盼藍(lán)染色3 min，觀察活細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞活性在98%以上。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理 胃癌BGC-823細(xì)胞株隨機(jī)分為對(duì)照組和不同方法提取的各樺褐孔菌提取物組，即樺褐孔菌水提取物組、石油醚提取物組、乙酸乙酯提取物組，每個(gè)組又分為10、20、40、80 g/ml四個(gè)劑量組。各組分別在培養(yǎng)48 h時(shí)收集腫瘤細(xì)胞并觀察細(xì)胞的變化。

1.5 藥物毒性實(shí)驗(yàn) 樺褐孔菌提取物對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用，采用MTT比色法，計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。藥物抑制率(%)=〔1－(實(shí)驗(yàn)組A值－對(duì)照組 A值)/對(duì)照組A值〕×100%，A值為492 nm實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)下測(cè)定的每孔的光吸收值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

樺褐孔菌水提取物、醚提取物、酯提取物在10～80 g/ml范圍內(nèi)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞株均有抑制作用，并表現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系。樺褐孔菌酯提取物組10、20、40、80 g/ml各作用腫瘤細(xì)胞48 h時(shí)，其抑制率分別為21%、33%、49%、62%;醚提取物組分別為17%、35%、39%、60%;水提取物組分別為20%、36%、47%、51%。80 g/ml醚提取物和酯提取物的抑制率和水提取物之間有顯著性差異(P＜0.01);相同濃度醚提取物和酯提取物對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞株抑制作用無(wú)差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 樺褐孔菌的不同提取物作用于人胃癌BGC-823細(xì)胞株48 h的抑制

3 討論

人們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)〔5〕中發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌提取物具有明顯的腫瘤抑制作用。本結(jié)果以樺褐孔菌醚提取物和酯提取物的抑制率明顯。樺褐孔菌水提取物主要成分有多酚化合物單寧酸、多糖及可溶性蛋白質(zhì)和脂肪等。單寧酸是一種廣泛分布在植物體內(nèi)的多酚類化合物，具有抗誘變、抗腫瘤、抗癌的作用，對(duì)肺、皮膚、胃、結(jié)腸癌細(xì)胞有很好抑制作用〔6〕。Cui等〔7〕也發(fā)現(xiàn)多酚化合物具有細(xì)胞毒作用、清除自由基和很強(qiáng)的抗氧化作用。真菌水提取物多糖中，水溶性較高的葡聚糖的生物活性較高，β-1，3-D-葡聚糖具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的生物活性，真菌多糖對(duì)多種腫瘤具有抗腫瘤作用〔8〕。

He等〔9〕將樺褐孔菌醚提取物中分離出三種新的羥脂甾烷三萜類化合物，趙芬琴等〔4〕分離出 3，22 R-dihydroxy-lanosta-8，24-diene(inotodio1)，是樺褐孔菌的抗突變活性成分，Cui等〔7〕發(fā)現(xiàn)三萜類具有細(xì)胞毒作用、清除自由基和抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)提示醚提取物和酯提取物活性成分三萜類化合物有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。

關(guān)于樺褐孔菌提取物的抗腫瘤作用機(jī)制還不十分清楚。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌的水提取物對(duì)體外的人類子宮頸腫瘤細(xì)胞HelaS3，通過(guò)影響有絲分裂指數(shù)和酶活性來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)〔3，10〕。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)水提取物、醚提取物、酯提取物均能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期的S期〔11，12〕，和通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

以上實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌3種提取物在體外均能抑制胃癌細(xì)胞株BGC-823增殖，其中醚提取物、酯提取物抑制率最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，樺褐孔菌3種提取物中，除了多糖、多酚類化合物外，通過(guò)醚和(或)酯提取法提取分離的樺褐孔菌中的三萜類單體，對(duì)進(jìn)一步研究樺褐孔菌的抗腫瘤作用具有重要意義，應(yīng)繼續(xù)深入研究。

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