芡實提取物對D－半乳糖衰老小鼠學習記憶障礙的改善作用

沈 蓓 吳啟南 陳 蓉 王新勝 袁冬平 伍城穎 陳廣云

(南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210046)

芡實具有益腎固精、補脾止瀉的功效，素有“水中人參”和“水中桂圓”的美譽。芡實水和乙醇提取物有較強的抗氧化和清除OH·自由基和· 自由基的作用〔1，2〕，這為其能延緩衰老提供了基本依據(jù)。芡實化學成分復雜，含氨基酸〔3〕、多糖〔4〕、多酚〔5〕、黃酮〔6〕、不飽和脂肪酸〔7〕、微量元素〔8〕等多種成分，但有關其延緩衰老有效部位的報道甚少。本實驗采用D-半乳糖致小鼠亞急性衰老模型，分別灌胃芡實乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物高低劑量溶液，觀察小鼠行為和多項腦指標變化的方法，評價其延緩衰老的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠曠場裝置(上海軟隆科技發(fā)展有限公司);SLY-WMS型Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司);FSH-2A可調(diào)高速電動勻漿機(金壇市金南儀器廠);LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機(南京曉曉儀器設備有限公司);Powerwave X340全波長酶標儀(美國Bio-Tek公司);芡實購于北京中葛綠元科技有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為為睡蓮科植物芡Euryale ferox Salisb.的干燥成熟種仁。芡實乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物由實驗室自行制備;D-半乳糖(上海寶曼生物有限公司);一氧化氮合酶(NOS)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);清潔級昆明種小鼠104只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，合格證號:SCXK(蘇)2009-0002，江蘇大學實驗動物中心提供。實驗中有小鼠死亡。

1.2 方法

1.2.1 不同提取物的制備 芡實乙醇提取物的制備:稱取芡實整粒2 000 g，用8倍量80%乙醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，減壓濃縮為浸膏。芡實乙酸乙酯提取物的制備:同上述乙醇提取物的制備，減壓濃縮后的浸膏用水混懸，以少量多次原則，乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浸膏，干燥備用。芡實正丁醇提取物的制備:稱取芡實整粒2 000 g，用8倍量水飽和正丁醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，減壓濃縮為浸膏。臨用前用生理鹽水配成所需濃度。

1.2.2 動物分組及給藥 將昆明種小鼠隨機分為8組，每組13只，分別為對照組、模型組、芡實乙醇提取物高、低劑量(500、250 mg·kg－1·d－1)組、芡實乙酸乙酯提取物高、低劑量(300、150 mg·kg－1·d－1)組、芡實正丁醇提取物高、低劑量(100、50 mg·kg－1·d－1)組，以上三種提取物高、低劑量分別換算成生藥量均一致。模型組和給藥組每日上午腹腔注射D-半乳糖500 mg·kg－1·d-1，空白組注射等量生理鹽水，下午給藥組分別灌胃相應濃度的藥物，空白組和模型組分別灌胃等量的生理鹽水，給藥量均為0.1 ml/10 g，連續(xù)42 d，并用曠場和Morris水迷宮裝置測試模型制備的成功。

1.2.3 曠場實驗 各組小鼠給藥42 d后，將其置于曠場中央，開始計時，用Anymaze動物行為學視頻分析系統(tǒng)記錄并分析小鼠90 s內(nèi)的自主探究情況，包括運行軌跡、在周邊區(qū)和中央?yún)^(qū)的運動速度、總區(qū)域跨行次數(shù)等。每實驗完1只小鼠將曠場箱打掃干凈，再進行下一只的實驗。

1.2.4 Morris水迷宮實驗 定位航行實驗:從造模和給藥第38天開始，每日于注射和灌胃后進行訓練，上、下午各1次，歷時5天。將小鼠面向池壁，從平臺對角象限固定入水點放入水中，記錄120 s內(nèi)找到平臺的時間，如未能找到平臺，則將其引至上面停留10 s，再放回籠中，潛伏期記為120 s。空間探索實驗:定位航行實驗結束后24 h，移出平臺，仍從平臺對角象限固定入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)，以衡量小鼠對水迷宮記憶的獲取能力。

1.2.5 腦組織蛋白質(zhì)、NOS、GSH-Px、AChE活性的測定 實驗結束后，取腦組織冰浴研磨，并用冷生理鹽水制成10%腦勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液按試劑盒方法，測定腦組織中蛋白質(zhì)、NOS、GSH-Px、AChE 活性。

2 結果

2.1 曠場實驗 與對照組相比，模型組小鼠的運動速度及總跨越次數(shù)均明顯降低(P＜0.01)，與模型組相比，芡實乙醇、正丁醇提取物高低劑量組、乙酸乙酯提取物高劑量組均可使衰老小鼠的運動速度及總跨越次數(shù)明顯增加(P＜0.01)。見表1。

表1 芡實不同提取物對亞急性衰老小鼠曠場實驗的影響()

表1 芡實不同提取物對亞急性衰老小鼠曠場實驗的影響()

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01，下表同

13 19.89±8.28 9.03±1.46 19.29±4.00模型組 11 10.04±3.242) 4.05±0.962) 10.41±3.342)乙醇提取物高劑量組 13 18.48±7.544) 7.50±2.114) 18.65±4.434)乙醇提取物低劑量組 13 17.56±7.204)6.62±0.862)4)17.88±3.974)乙酸乙酯提取物高劑量組10 18.25±6.474)6.53±1.251)4)16.41±4.061)4)乙酸乙酯提取物低劑量組11 11.18±5.422) 5.13±1.342)13.53±4.962)3)正丁醇提取物高劑量組 13 18.60±5.574) 10.20±1.804)18.24±5.194)正丁醇提取物低劑量組 13 16.53±6.201)4)8.93±2.264) 17.00±5.124)對照組

2.2 水迷宮實驗 各實驗組潛伏期和穿越次數(shù)存在一定差異，模型組小鼠與對照組相比，潛伏期明顯增加(P＜0.01)，穿越次數(shù)減少。其他各給藥組與模型組相比，潛伏期均明顯減少，且穿越次數(shù)明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表2 芡實不同提取物對衰老小鼠定位航行和空間搜索實驗的影響()

表2 芡實不同提取物對衰老小鼠定位航行和空間搜索實驗的影響()

組別 n 平均潛伏期(s) 穿越原平臺次數(shù)(次)13 47.97±12.32 4.83±1.72模型組 11 80.89±22.242) 1.33±0.52乙醇提取物高劑量組 13 42.49±16.834) 3.67±1.374)乙醇提取物低劑量組 13 45.04±9.774) 3.50±1.054)乙酸乙酯提取物高劑量組 10 43.83±12.764) 3.33±1.513)乙酸乙酯提取物低劑量組 11 46.61±15.654) 2.67±0.821)4)正丁醇提取物高劑量組 13 38.09±14.201)4) 4.08±1.804)正丁醇提取物低劑量組 13 43.78±14.814) 3.17±1.473)對照組

2.3 芡實不同提取物對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px、AChE活性的影響 與對照組相比，模型組小鼠腦組織NOS、AChE顯著性下降或升高(P＜0.05)，GSH-Px活性升高(P＜0.01)。與模型組相比，芡實乙醇、正丁醇提取物高劑量組NOS活性升高(P＜0.05)，乙醇、正丁醇提取物高低劑量組、乙酸乙酯提取物高劑量組GSH-Px和AChE活性顯著性升高或降低(P＜0.01)。見表3。

表3 芡實不同提取物對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px、AChE 活性的影響()

表3 芡實不同提取物對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px、AChE 活性的影響()

組別 n NOS(U/mg) GSH-Px(U/mg)AChE(U/mg)13 0.49±0.16 39.31±3.60 0.65±0.03模型組 11 0.24±0.081) 30.47±1.622) 0.80±0.061)乙醇提取物高劑量組 13 0.38±0.113) 40.04±1.494)0.52±0.061)4)乙醇提取物低劑量組 13 0.35±0.12 37.11±2.924) 0.58±0.044)乙酸乙酯提取物高劑量組10 0.33±0.12 38.00±1.324)0.52±0.012)4)乙酸乙酯提取物低劑量組11 0.26±0.091) 32.83±1.101) 0.66±0.013)正丁醇提取物高劑量組 13 0.39±0.103)51.16±1.462)4)0.48±0.101)4)正丁醇提取物低劑量組 13 0.36±0.17 40.89±0.674)0.54±0.022)4)對照組

3 討論

本實驗采用小鼠腹腔注射D-半乳糖的方法來建造亞急性衰老模型，其原理是在一定時間內(nèi)連續(xù)注射 D-半乳糖，細胞內(nèi)半乳糖濃度增高，經(jīng)醛糖還原酶催化后還原成半乳糖醇，該物質(zhì)不能被進一步代謝而堆積在細胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹，代謝紊亂，氧自由基堆積，最終致機體衰老。曠場、Morris水迷宮的實驗結果證實了芡實乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物對亞急性衰老小鼠的學習記憶能力有一定的改善作用。腦組織抗氧化相關酶測試顯示以上三種提取物可以提高亞急性衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px活力，降低 AChE活力。兩項實驗結果有著明顯的相關性，且芡實正丁醇提取物的作用優(yōu)于乙醇和乙酸乙酯提取物。

NOS在體內(nèi)能催化NO生成，NO既是一種神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種極不穩(wěn)定的強氧化劑，但腦內(nèi)過多的NO沉積會發(fā)生細胞毒性反應，這可能與誘生型NOS的過表達有關。本實驗結果證實了小鼠在衰老過程中，NOS活力會下降且芡實三種提取物對衰老過程中NOS的活力起到了一定的影響作用。

GSH-Px是體內(nèi)清除H2O2和許多過氧化物的重要酶〔9〕。實驗數(shù)據(jù)顯示，芡實乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物能提高亞急性衰老小鼠腦組織GSH-Px的活力，并隨劑量的增高，酶活性有增加的趨勢，說明芡實以上三種提取物具有良好的抗氧化能力，能夠增強機體對自由基的清除，從而在抗衰老過程中發(fā)揮作用。

AChE是在膽堿能神經(jīng)元的突觸處水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)的酶，AChE含量的變化在一定程度上可體現(xiàn)膽堿能神經(jīng)元的功能活性。芡實三種提取物能夠降低亞急性衰老小鼠腦組織AChE的活力，以提高小鼠腦內(nèi)ACh的含量，這可能是芡實提取物改善衰老引起的學習記憶功能下降的機制之一。

本研究結果初步表明芡實乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物均能起到延緩衰老、改善學習記憶能力的作用，其機制可能是通過促進脂類過氧化物的清除，增強腦組織抗氧化能力，改善膽堿能系統(tǒng)在學習和記憶中的作用等實現(xiàn)。芡實作為一種藥食兩用的水產(chǎn)品，其藥用價值正在被逐步挖掘。本實驗結果顯示了芡實脂溶性提取物在延緩衰老方面的作用，為芡實擴大臨床應用提供了一定的實驗基礎。

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