潰瘍性結腸炎患者病灶組織血管內皮生長因子、細胞外調節蛋白激酶－1、－2表達與病程的相關性

劉寶海 樸雪花(遼寧醫學院附屬第一醫院消化科，遼寧 錦州 200)

潰瘍性結腸炎主要因結腸黏膜表皮潰瘍，導致腸道無法發揮正常消化吸收功能，進而造成排便困難和便血等癥狀，臨床主要以腹瀉、排便出血等癥狀為主〔1〕。老年人患潰瘍性結腸炎后，身體虛弱，抵抗能力急劇下降，各方面體征較年輕人嚴重〔2〕。本文主要探討血管內皮生長因子(VEGF)、細胞外調節蛋白激酶-1(ERK-1)和ERK-2與不同程度的潰瘍性結腸炎的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 128例潰瘍性結腸炎患者為2011年1月至2012年1月來中國醫科大學附屬盛京醫院與北京中醫藥大學附屬東直門醫院接受診斷和治療，按照診斷結果可分為四組。30例初發型潰瘍性結腸炎患者為初發型組，男16例，女14例，年齡51～66〔平均(56.7±2.4)〕歲;31例慢性復發型潰瘍性結腸炎患者為慢性復發性組，男17例，女14例，年齡51～66〔平均(57.1±3.3)〕歲;32例慢性持續型潰瘍性結腸炎患者為慢性持續型組，男17例，女15例，年齡51～66〔平均(57.9±4.2)〕歲;34例急性暴發型潰瘍性結腸炎患者為急性暴發性組，男17例，女17例，年齡51～66〔平均(56.2±2.6)〕歲。四組患者性別比、平均年齡無顯著性差異，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 納入標準 (1)通過造影檢測診斷為潰瘍性結腸炎，可在結腸處觀察到明顯潰瘍病灶;(2)年齡≥50歲;(3)具有反復發作的腹瀉、腹痛、黏液便、膿液便等典型的臨床表現，至少有結腸鏡“X”線特征性改變中的一項;(4)細菌性痢疾、阿米巴性結腸炎等病因明確的結腸炎排除在外;(5)非潰瘍性結腸炎腹瀉、腹痛、便秘等常見的臨床癥狀排除在外;(6)結腸潰瘍外的胃潰瘍等消化道疾病排除在外。

1.2.2 內鏡檢查 集中對患者直腸和乙狀結腸處進行內鏡掃描，觀察黏膜表面是否有潰瘍、潰瘍類型以及面積等。各種類型潰瘍性結腸炎檢查標準:(1)初發型:內鏡檢查診斷為潰瘍性結腸炎，且為首次未有過往史;(2)慢性復發型:內鏡檢查診斷為潰瘍性結腸炎，既往結腸炎患病史，又復發，且病變范圍較之前小;(3)慢性持續型:內鏡檢查為潰瘍性結腸炎，且屬首次，病程有半年以上，伴持續性腹瀉、腹痛等癥狀;(4)急性暴發性:內鏡檢查為潰瘍性結腸炎，發病快，癥狀嚴重且伴有高熱、急性結腸擴張等癥狀。

1.2.3 病灶組織VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA水平檢測所有患者在進行內鏡檢查時，鏡頭均觸及潰瘍病灶處，取出鏡頭后收集鏡頭上的組織殘留物，使用TAKARA的mRNA抽提試劑盒進行總mRNA抽提。使用TAKARA逆轉錄試劑盒擴增出cDNA，然后使用各自引物擴增VEGF、ERK-1、2片段，同時擴增出內參分子β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA。使用2%瓊脂糖電泳擴增片段，并且使用Bio-rad凝膠成像儀和Image Lab軟件進行拍照和光密度分析。

1.2.4 病灶組織 VEGF，ERK-1和ERK-2免疫組化檢測 取出患者病灶組織后，用4%多聚甲醛固定8 h后，用20%蔗糖脫水3 d(4℃)，用冷凍切片機切成冠狀切片，收集于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，然后分裝進96孔板中，每個患者組織做三個復孔。按照參考文獻〔3〕進行操作，一抗為大鼠抗VEGF、ERK-1、2多抗，采用濃縮型鏈霉素和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產)進行實驗，二抗為試劑盒自帶的兔抗大鼠Fc段抗體，采用試劑盒顯色方法進行顯色，并拍照。

1.3 統計學方法 應用SPSS12.0統計軟件進行分析，數據資料以表示，所有計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 病灶組織細胞內VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA水平以β-actin光密度為內參，四組患者病灶組織VEGF和ERK-1、2 mRNA相對光密度值逐漸增加，說明老年潰瘍性結腸炎逐漸增加，病灶組織細胞內VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA轉錄水平逐漸增加。見圖1。

2.2 病灶組織VEGF，ERK-1和ERK-2免疫組化結果 VEGF陽性率、ERK-1、2陽性率均隨著潰瘍性結腸炎進展而不斷增加。四組患者VEGF和ERK-1、2平均陽性率逐漸增多，在急性暴發性患者中VEGF陽性率高達39.59%，ERK-1陽性率高達31.47%，ERK-2陽性率高達24.12%，比較各組間陽性率有顯著性差異(均P＜0.05)。見圖2，圖3。

圖1 病灶組織內VEGF、ERK-1和ERK-2 mRNA水平

圖2 病灶組織VEGF，ERK-1和ERK-2免疫組化結果

圖3 四組患者病灶組織VEGF，ERK-1和ERK-2陽性率比較

3 討論

認為病灶組織VEGF、ERK-1和ERK-2是潰瘍性結腸炎發生的危險因素，其表達水平隨著病情的進展而增加，具有預測潰瘍性結腸炎嚴重程度的潛在價值。

潰瘍性結腸炎屬于炎癥性腸病，主要是由于腸道發生炎癥損傷導致〔4〕，目前發病機制仍不確切，主要為基因因素、機體免疫力和環境因素三種原因單獨或者多方面原因綜合導致〔5〕。其中機體免疫抵抗力是老年人易發潰瘍性結腸炎的主要病因。有研究發現老年患者腸道黏膜免疫系統抵抗細菌的侵襲能力較年輕人弱，同時M細胞的數量也大大降低，該因素與潰瘍性結腸炎發生率具有正相關性〔6〕。

潰瘍性結腸炎的診斷包括內鏡、鋇灌腸和相關因子檢查，內鏡和灌腸檢查可直接觀察出病灶處潰爛狀態，并且能夠區分出不同類型潰瘍性結腸炎，在臨床上被證明陽性檢出率高達90%以上〔7〕。但隨著人們對生活質量的不斷追求，內鏡檢查和鋇灌腸檢查逐步被取代，從而限制了該方法在老年患者身上大量應用。內鏡檢查易發人體嘔吐，痙攣等〔8〕，鋇灌腸檢查殘余的鋇鹽會對機體特別是對老年人帶來危害〔9〕。

相關因子例如細胞因子、各類代謝因子等均被證明與老年潰瘍性結腸炎具有相關性。有研究表明，病灶位置處細胞膜上趨化因子受體表達量較正常組織顯著提高〔10〕，說明患病后大量的趨化因子會富集在病灶位置發揮著炎癥作用。VEGF和ERK-1/2均被證明與潰瘍性結腸炎相關，其中VEGF被認為是腫瘤新生血管非特異性標記物，新生血管需要VEGF和受體的作用而發揮血管再生功能，但這VEGF的過表達在結腸炎潰瘍組織處也被發現，表明該因子與炎癥相關〔11〕，本文發現在病灶位置處確實存在VEGF隨著病情加重逐漸增多的現象，mRNA轉錄的增加說明VEGF非其他組織通過血液轉移過來，而是組織本身細胞表達增加的緣故。ERK-1/2是有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶信號通路中關鍵的信號蛋白，通過磷酸化發揮著信號通路開啟和關閉功能，從而引導轉錄因子的開啟和關閉，控制著細胞因子等的表達。有研究表明ERK-1/2在潰瘍性結腸炎中確實存在磷酸化，起到連接轉移生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子(TNF)細胞內發揮功能的作用。本文的研究結果與VEGF類似，證明了ERK-1/2非旁分泌作用轉移到病灶位置，而是通過自分泌方式在病灶位置大量表達，從而發揮其生物學功能。

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11 〔No authors listed〕VEGF contributes to ulcerative colitis pathogenesis〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2009;328(3):681.