磷脂酶D的紫外誘變選育及發酵條件的優化

劉媛媛，張小里，姚 娜，李紅亞，趙彬俠

（西北大學化工學院，陜西 西安 710069）

磷脂酶D的紫外誘變選育及發酵條件的優化

劉媛媛，張小里，姚 娜，李紅亞，趙彬俠

（西北大學化工學院，陜西 西安 710069）

磷脂酶D在催化磷脂酰基交換反應中具有重要的應用價值。本文對產磷脂酶D野生鏈霉菌株進行紫外誘變，篩選得到一株產酶活力提高42.5%的變異株。通過搖瓶培養，對發酵條件進行探究。確定的最佳培養基組成為：葡萄糖10.0 g/L，牛肉膏和蛋白胨各5.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl23.0 g/L，NaCl 2.0 g/L；表面活性劑Tween80對產酶有促進作用，其適宜濃度為0.60 g/L。在上述條件下，搖瓶發酵產酶活力達3.23 U/mL。

磷脂酶D；誘變；磷脂酰基轉移；發酵

磷脂酶D（phospholipase D，EC3.1.4.4，簡稱PLD)，即磷脂酰膽堿水解酶，能催化水解卵磷脂（PC）釋放出磷脂酸和膽堿，在醇類物質存在下，一些PLD亦能催化磷脂酰基轉移反應，將具有羥基的底物與膽堿的極性頭部進行交換反應，生成新磷脂[1-3]。PLD催化的磷脂酰基轉移反應可合成許多稀有或半合成磷脂，廣泛應用于食品、醫藥等領域。據報道，稀有鏈霉菌株是磷脂酰基轉移活力PLD主要生產菌，然而，野生菌株的酶產量普遍很低[4]。

本工作利用前期篩選得到的一株產磷脂酰基轉移活力 PLD野生鏈霉菌株，通過紫外誘變篩選育種，改良菌株的產酶能力；并且，對所篩選高產菌株發酵生產磷脂酶D的最佳工藝條件進行探究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

磷脂酶D產生菌Streptomyces PLD0606，由本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

孢子萌發培養基（g/L）：酵母浸粉 10.0；蛋白胨 10.0；CaCl2，0.01 mol/L。

PDA 培養基（g/L）：馬鈴薯 200.0；葡萄糖20.0；瓊脂 20.0。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖 10.0；蛋白胨 7.5；酵母浸膏 20.0；K2HPO42.0；MgSO4·7H2O 0.5；pH值 6.8～7.2。當探索最佳條件時，組分及濃度進行必要調整。

1.1.3 試 劑

薄層層析硅膠板（GF254），青島海洋化工集團；瓊脂粉（BR），北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨（BR），天津市大茂化學試劑廠；磷脂酰基對硝基酚（p-PNP）為本實驗室合成。其它試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 單孢子懸液的制備

原始菌株于 PDA斜面培養基上 28 ℃培養 7天，無菌水洗孢子，轉至帶玻璃珠的試管充分震蕩，濾紙過濾。調整孢子濃度為107個/mL數量級。

1.2.2 孢子預萌發及誘變劑量的確定

將1 mL單孢子懸液加入到裝有5 mL萌發培養基的搖瓶中，搖床培養，經過0、2 h、4 h、6 h后分別取樣，于培養皿中紫外線照射2 min測算孢子致死率。結果表明培養4 h的孢子懸液對紫外線最敏感，最適宜紫外線處理。在相同條件下制備敏感孢子懸液，紫外線照射一定時間后，暗培養7天后，統計致死率，確定適宜的誘變劑量。

1.2.3 誘變處理

按照上述方法處理，采取先紫外照射30 s，然后置于日光燈下光修復30 min，再在紫外燈下照射90 s。28 ℃避光培養3天后，再取出正常培養4天。

1.2.4 突變株的篩選

從培養 7天的誘變平板上挑選單菌落接種斜面，培養后，搖瓶發酵測定PLD水解活力進行初篩；測定磷脂酰基轉移活力進行復篩。

1.2.5 傳代穩定性試驗

將突變株進行連續傳代，測定PLD發酵水平，并以第一代為基準進行相比較。

1.2.6 PLD活力測定

PLD水解活力以p-PNP為底物依分光光度法測定[2]。磷脂酰基轉移活力以 PC轉化為磷脂酰乙醇胺（PE）的反應測定，PC及PE濃度以氯仿-甲醇-水（13:5:0.8，體積比）為展開劑、GF254硅膠板TLC測定；碘蒸氣染色的薄層板用圖像處理軟件測量斑點面積及灰度值，計算出磷脂組分濃度。酶蛋白質濃度依 Bradford法以牛血清蛋白為標準進行測定[5]，并用于PLD比活力測定。

2 結果與討論

2.1 紫外誘變劑量

鏈霉菌PLD0606經過紫外線照射不同的時間，在28 ℃下培養7天后，統計其致死率，結果見表1。由表1可見，致死率隨紫外線照射時間加長而增加，90～120 s時致死率達90%左右。故選擇紫外線照射120 s作為適宜的誘變劑量，此時的正突變率一般較高。

表1 鏈霉菌紫外誘變致死率

2.2 突變株的篩選

如表2所示，挑取經過紫外誘變的不同形態單菌落接種斜面，發酵測試酶產量進行初篩和復篩。發現與原始菌落（編號 0）形狀相同、但孢子飽滿的變異株PLD產量顯著增加。菌落形態均呈梅花褶皺型，但變異株產 PLD磷脂酰基轉移活力提高約42.5%。

2.3 傳代穩定性結果

傳代試驗結果如表3所示，表明此突變株具有較為穩定的遺傳性能，高產磷脂酶D性能在菌株傳代保藏和培養發酵過程中不易丟失，具有應用價值。

表2 紫外誘變結果

表3 傳代次數與相對酶活的關系

2.4 氮源對發酵產酶的影響

在預實驗中已確定適宜碳源為葡萄糖10.0 g/L的基礎上，研究牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、花生粉、黃豆粉等常見復合氮源對變異株產 PLD的影響。選擇牛肉膏15.0 g/L，蛋白胨15.0 g/L，牛肉膏、蛋白胨各7.5 g/L時，菌絲生長情況及酶活力如表4所示。在相同濃度下，不同的天然有機氮源對鏈霉菌產酶影響效果并不顯著，均能被鏈霉菌充分利用，其菌絲生長情況良好。當選用牛肉膏+蛋白胨復合有機氮源時，酶活力比用單一氮源牛肉膏或蛋白胨時有所提高，但提高效果并不明顯。

圖1描述了牛肉膏、蛋白胨作混合氮源時，其濃度對PLD相對活力的影響。在用量均為5.0 g/L時相對酶活力達到最大。

2.5 無機鹽對產酶的影響

發酵培養基中的其它組分不變，分別對CaCl2、MgSO4·7H2O、NaCl三種無機鹽進行單因素實驗，考察對鏈霉菌發酵產酶的影響。結果如圖2所示，三種無機鹽均對產酶有顯著影響，當 CaCl2、MgSO4·7H2O、NaCl濃度分別達到為 3.0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L時產酶效果最好。

表4 不同天然氮源對鏈霉菌發酵產酶的影響

圖1 氮源濃度對鏈霉菌發酵產酶的影響

圖2 不同種類無機鹽濃度對鏈霉菌產酶的影響

2.6 表面活性劑對產酶的影響

表面活性劑能改變細胞膜透過性，從而有利于胞內酶擴散至培養基中。本文選用Tween 60、Tween 80、PEG 2000、Span五種表面活性劑試驗對鏈霉菌產酶的影響，其濃度均為0.2 g/L，實驗結果圖3所示。由圖3可以看出，Span和Tween 80對鏈霉菌產酶有一定的促進作用，而Tween 80的作用較為明顯。

圖4即顯示不同Tween 80濃度對鏈霉菌產酶的影響。由圖4可知，當Tween 80達到最佳的添加劑量0.6 g/L時，PLD相對活力最大。而后，當繼續加大表面活性劑的用量時，酶活力基本不變。

適宜氮源、無機鹽濃度下，結合表面活性劑作用，本文搖瓶發酵最好水平對應的PLD活力達3.23 U/mL。

3 結 論

圖3 表面活性劑種類對鏈霉菌發酵產酶的影響

圖4 Tween80不同濃度對鏈霉菌產酶的影響

通過紫外誘變改良，得到一株PLD高產菌株，酶活力相較原始菌株提高了約42.5%，傳代穩定性良好。對變異株發酵條件進行了優化，實驗結果表明，培養基成分對產酶效果有一定影響。天然氮源牛肉膏與蛋白胨等量配合，濃度各為5.0 g/L時產酶效果較好；無機鹽 CaCl2、MgSO4·7H2O、NaCl，濃度分別為3.0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L效果較佳；表面活性劑Tween80對產酶有促進作用，其適宜濃度為0.6 g/L。優化條件下，搖瓶發酵磷脂酶D活力達到3.23 U/mL。

[1] 陳石良，許正宏，孫微.磷脂酶D的研究進展[J].工業微生物，1999，29（4）：47-50.

[2] Paola D，Arrigo，Valentino Piergianni，et al. A spectrophotometric assay for phospholipase D[J].Analytica Chimica Acta，1995，304（2）：249-254.

[3] Paola D，Arrigo，Trefano Sevi. Using phospholipases for phospholipids modification[J]. Tibth March，1997，15（3）：90-96.

[4] Yoshiko Uesugi，Tadashi Hatanaka. Phospholipase D mechanism using Streptomyces PLD[J].Biochimica et Biophysica Acta，2009，1791（9）：962-969.

[5] Tsaffrir Z，Selinger Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity：Theoretical and experimental studies[J].AnalyticalBiochemistry，1996，236：302-308.

Ultraviolet mutagenesis breeding and fermentation conditions of phospholipase D producing strain

LIU Yuanyuan，ZHANG Xiaoli，YAO Na，Li Hongya，Zhao Binxia
（School of Chemical Engineering，Northwest University，Xi’an 710069，Shaanxi，China）

Phospholipase D (PLD) catalyzed transphosphatidylation reaction plays an important and useful role in synthesis of phospholipids. In the present paper，a PLD-high-producing strain was selected by ultraviolet mutagenesis from wild Streptomyces and its PLD activity was increased by 42.5% against the original strain. The PLD producing conditions for the mutant strain was investigated in shake flask fermentation. The optimized components (g/L) of culture medium were 10.0 of glucose，5.0 of beef extract，5.0 of peptone，1.0 of MgSO4·7H2O，3.0 of CaCl2，and 2.0 of NaCl. The enzyme productivity could also be enhanced by the supply of surfactant i.e. Tween 80，and its optimal concentration was 0.6 g/L. Under the above conditions，3.23 U/mL of enzyme activity was achieved in 500 mL of shake flask fermentation.

phospholipase D；mutagenesis；transphosphatidylation；fermentation

TQ 925+9

：A

：1000-6613（2012）09-2036-04

2012-04-16 ；修改稿日期：2012-05-11。

陜西省科技攻關計劃（2004K08-C24）及陜西省教育廳產業化項目（04JC05）。

劉媛媛（1987—），女，碩士研究生。聯系人：張小里，教授，博士生導師，研究方向為生物催化過程、催化反應工程。E-mail xlzhang@nwu.edu.cn。