重組黑曲霉產大豆異黃酮糖苷酶發酵條件的研究

王丹

（1.吉林農業大學，吉林長春 130118；2.長春醫學高等專科學校，吉林長春 130031）

近年來很多學者對大豆異黃酮開展了廣泛而深入的研究，研究結果表明：大豆異黃酮是一類重要的生理活性物質，具有較強的生理功能，具有弱雌激素、抗氧化、抗溶血等活性，能夠有效地預防和抑制骨質酥松、癌癥和婦女更年期綜合癥等疾病的發生[1－2]；迄今為止，已知大豆異黃酮共有12種異構體，分為游離型的苷元和結合型的糖苷2類，其中苷元占總量的2%～3%，糖苷占總量的97%～98%。但天然糖苷類的分子結構并不是活性的最佳狀態，具有生理活性的成分主要是大豆異黃酮苷元[3－4]；21世紀以來獲得大豆異黃酮苷元的方法主要是酸解法和酶解法，但人們對酸解法得到的大豆異黃酮苷元的穩定性有所懷疑，二酶法由于具有反應條件溫和，得到的大豆異黃酮苷元不易變形等優點，成為制備大豆異黃酮苷元的最佳途徑。

迄今國內外對高產活性大豆異黃酮糖苷水解酶的研究正處于研制階段，工業化生產還較為罕見[5]。本文試圖探討利用一株通過誘變得到的黑曲霉產大豆異黃酮糖苷酶產生菌，對其產酶的發酵工藝條件進行了研究，旨在為工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉誘變株：再生資源利用吉林農業大學食品生化與功能性食品實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養基

斜面培養基：20%馬鈴薯汁100 mL，蔗糖1.5 g，pH自然。

產酶基礎培養基：麩皮 2.0 g，（NH4）2SO41.5 g，KH2PO40.05 g，水100 mL，pH自然。

1.1.3 主要試劑及儀器設備

水楊素：Sigma公司；其它試劑為分析純。723分光光度計：上海棱光技術有限公司；PDX－650B恒溫電熱培養箱：沈陽市醫療器械研究所；SHZ－82A國華水浴恒溫振蕩器：中科院武漢科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養

將菌種接種到斜面培養基上，于28℃培養72 h。

1.2.2 液體發酵培養

將一定量的無菌水倒入斜面培養的菌液試管中刮洗，制得孢子懸液。將其定量加入到產酶基礎培養基中，28℃、200 r/min振蕩培養72 h。經過濾制得粗酶液，測定酶活力。

1.2.3 酶活力的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制

分別取 0.1%標準葡萄糖溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 于 50 mL 的編號為 1 號～11號得比色管中。向每支比色管中加入蒸餾水至2.0mL；再分別加入 2.0 mL DNS（3，5－二硝基水楊酸），沸水浴中顯色5 min；迅速冷卻后加蒸餾水定容至50 mL，用723分光光度計于波長510 nm處測定吸光度值。以葡萄糖量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3.2 大豆異黃酮糖苷酶活的測定

取經適當稀釋的酶液0.1 mL，1%水楊素溶液（用pH4.6、0.1 mol/L醋酸緩沖液配制）0.9 mL，于50℃下保溫30 min。用DNS法在510 nm處測定還原糖（以葡萄糖計），以滅活（100℃，10 min）的酶液作對照。

2 結果與分析

2.1 碳源對菌株產酶的影響

以產酶基礎培養基為基礎，改變其中碳源的種類進行產酶實驗，結果見圖1。

圖1 不同碳源對菌株產酶的影響Fig.1 The effection of different carbon sources on enzyme production of strain

從圖1可以表明該菌株可以利用玉米芯和麩皮作為碳源，而且以4%麩皮和2%玉米芯的復合碳源為培養基的產酶活性最好。利用玉米芯和麩皮這些農業生產的廢棄物作為碳源對于該菌株的工業化生產大幅度降低成本具有一定的現實意義。

2.2 氮源對菌株產酶的影響

選擇不同的氮源替代產酶基礎培養基中的（NH4）2SO4進行試驗，結果見圖 2。

圖2 不同氮源對菌株產酶的影響Fig.2 The effection of different nitrogen sources on enzyme production of bacteria

從圖2可以看出，以豆餅粉和NH4Cl作為復合氮源時產酶活力最高。無機氮源的添加可以提高產酶，但當無機氮源添加量超過2%時對產酶不利。

2.3 接種量對菌株產酶的影響

分別以 6%、8%、10%、12%、14%的接種量在250 mL的錐形瓶中進行搖瓶實驗，測定酶活力，結果見圖3。

從圖3可知，當接種量為10%時酶活力最高，接種量增加或減少，酶活力都會有不同程度地降低。

2.4 培養基起始pH對菌株產酶的影響

培養基的pH會影響細胞表面帶電基團的解離及其微觀結構，從而影響營養物質的吸收和代謝產物的分泌，導致微生物的生長和代謝發生改變。因此，調節培養基的起始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0進行產酶實驗，結果見圖4。

由圖4可知，培養基起始pH為6.0較適合菌株的產酶。

2.5 培養時間對產酶的影響

將孢子懸浮液定量接入產酶基礎培養基，培養24 h后開始測定酶活力，每隔12小時測定一次，直至96 h，結果見圖 5。

表2 正交試驗方案及結果Table 2 Orthogonal experimental program and results

從圖5可知，培養36 h開始產酶，當培養72 h時產酶基本達到最高值。

2.6 不同因素對產酶的影響

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗，研究研究氮源、碳源、接種量和KH2PO4這4個因素對菌株產酶的影響，因素水平見表1。

表1L9（34）正交試驗的因素和水平Table 1L9（34）orthogonal test factors and levels

通過極差分析方法可知，如表2所示，各因素對菌株產酶的影響的大小順序為：氮源（B）＞KH2PO4添加量（D）＞碳源（A）＞接種量（C），正交結果顯示，最優工藝組合為A2B2C3D3，經實驗驗證，此組合被確定為最佳工藝，即最佳產酶條件為：以麩皮和玉米芯為碳源，豆餅粉和NH4Cl為混合氮源，添加0.1%KH2PO4制備成pH為6.0培養基，接種量為10%，置于28℃的培養溫度，200 r/min振蕩培養72 h，可獲得較高的產酶活性，可達 2.463×1010kat/mL。

3 結論與討論

通過對利用野生型黑曲霉誘變菌株發酵生產大豆異黃酮糖苷酶的發酵條件進行優化的研究，初步確定培養條件為：培養基組分為麩皮4%、玉米芯2%、黃豆粉 2%、NH4Cl 2%、KH2PO40.1%，pH 為 6.0，接種量為10%，培養溫度為28℃，72 h的條件下培養可獲得較高的產酶活性，可達2.463×1010kat/mL。

該菌株可利用玉米芯、豆餅粉等工業生產的廢棄料作為營養基質產生大豆異黃酮糖苷酶，有利于采用微生物法制備異黃酮苷元的工業產業化的推廣，有一定的參考價值。

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[1]Adlercreutz H.Phytoestrogens:epidermiology and a possible role in cancer protection[J].Environ health perspect,1995,103(7):103－112

[2]LEE Y B,LEE H J,SOHN H S.Soy isoflavones and cognitive function[J].J Nutr Biochem,2005,16(11):693－699

[3]井樂剛,張永忠.微生物發酵制備大豆異黃酮的研究進展[J].微生物學通報,2003,30(2):86－88

[4]唐傳核,彭志英.大豆蛋白水解物的苦肽以及脫除方法進展[J].中國油脂,2000,25(4):44－47

[5]孫艷梅,張永忠.水解制備大豆異黃酮甙元研究進展[J].食品研究與開發,2002,23(3):11－13