脫脂蛋黃蛋白粉酶水解實驗研究

李建穎，趙彥巧，吳子健，詹鳴昕

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

目前醫藥企業提取完藥用卵磷脂后，就將蛋黃粉下腳料廢棄，其實提取完藥用卵磷脂后的蛋黃粉還含有一定量的雞蛋蛋白質。雞蛋蛋白質是一種優質蛋白，消化率達98%，生物價達94，其氨基酸組成符合人體需要的模式[1]。如何更好地利用蛋黃粉的下腳料，是目前醫藥產業中一個值得研究的問題。高蛋白粉是一種有特色的產品，其蛋白質含量高達80%以上，脂肪和膽固醇含量較低，長期食用，沒有動物蛋白的副作用，不會引起肥胖、高血脂、心腦血管等疾病，具有較高的營養價值，也有較高的經濟效益和社會效益[2]。目前，國內外對雞蛋蛋白多肽的功能特性的研究報道較少。目前針對蛋黃研究產品僅有蛋黃油、卵黃免疫球蛋白、卵黃高磷蛋白，品種較少，還應將蛋黃中其他的蛋白質成分及其多肽進行充分利用[3]。因此，本文對蛋黃蛋白多肽的功能特性進行了研究，可為雞蛋蛋白多肽在嬰幼兒、老年人、病人等蛋白吸收機能較差人群的食品開發中的應用提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

蛋黃粉：購于北京金健力蛋粉廠；氫氧化鈉、濃鹽酸、三氯乙酸、甲醛、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、95%乙醇、無水乙醚等試劑：購于天津市江天化工技術有限公司，皆為分析純；丙酮、硫酸：購于天津市化學試劑批發公司，分析純；福林試劑B：購于鼎瑞化工（上海）有限公司，分析純；干酪素、L-酪氨酸：購于天津市光復化工精細研究所；胃蛋白酶、胰蛋白酶：購于中國上海化學試劑有限公司。

PHS-3B型精密pH計、FA1004型電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司；XMTD-204型數顯式電熱恒溫水浴鍋、EMS-2型加熱定時磁力攪拌器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；RE-52A旋轉蒸發儀：上海亞英生化儀器廠；DGG-H-3型電熱鼓風干燥箱 ：天津市天宇實驗儀器有限公司；UV-7054單光束紫外-可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；DL-6000型低速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；全自動凱氏定氮儀：蘇州市天威儀器有限公司。

1.2 脫脂蛋黃蛋白粉的制備

采用乙醇浸取法對蛋黃粉脫脂去油，具體操作方法[4]：稱取蛋黃粉加入錐形瓶中，加入15倍量乙醇脫脂，溫度40℃，間歇攪拌4 h，過濾，沉淀用少量溶劑洗，抽干，放入干燥箱中干燥，即得。

1.3 蛋白酶解液的制備

稱取一定量的蛋白粉，加水勻漿，濃度為5%（質量分數）左右，加1 mol/L氫氧化鈉或者1 mol/L鹽酸調節體系pH，加入指定重量的酶，置于一定溫度的水浴鍋中水浴中加熱一定時間后，在95℃下滅酶10 min，冷卻后，于6 000 r/min下離心15 min，取上清液即得酶解液。取酶解液，用半微量凱氏定氮法[5]測定總氮含量，用電位滴定法[6]測定氨基氮含量。

1.4 水解度的測定

蛋白質的水解度（DH）定義為在水解過程中打開的肽鍵占蛋白質肽鍵總數的百分比，其計算公式如下：

2 結果與討論

2.1 胃蛋白酶水解蛋白粉最適溫度的選擇

固定蛋白粉濃度為5%（g/mL，下同），酶濃度為1%，pH 為 2.0，溫度分別設為 30、38、40、45、50 ℃，反應4 h，其水解度測定結果見圖1。

由圖1可以看出，從30℃開始隨著溫度的升高，酶水解度逐漸增大，到38℃時水解度達到最大，其水解度為16.12%。隨著溫度繼續升高，蛋白質水解度急劇下降，到50℃達到最低。因此，可認為胃蛋白酶的最適溫度為38℃。

2.2 胃蛋白酶水解蛋白粉最適pH的選擇

固定蛋白粉濃度為5%，酶濃度為1%，溫度為38 ℃，分別調節 pH 為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，反應 4 h，其水解度見圖2。

由圖2可以看出，在pH在1.0時，隨著pH的升高，水解度逐漸增大，當pH達到2.0時，水解度達到最大值，其水解度為16.12%。隨著pH繼續增大，水解度程下降趨勢。因此，胃蛋白酶的最佳pH為2.0。

2.3 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳底物濃度選擇

固定酶濃度為1%，溫度為38℃，pH為2.0，分別配制蛋白粉濃度為2%、3%、4%、5%、6%，反應4 h，其水解度見圖3。

由圖3可以看出，當底物濃度在2%～3%時，蛋白質水解度隨底物濃度的增加而極具增大，當底物濃度在3%～4%與5%～6%時，蛋白質水解度隨底物濃度的增加而減小。在底物濃度為5%時，蛋白質水解度達到最大值，其水解度為16.49%。因此，胃蛋白酶酶解的最佳底物濃度為5%。

2.4 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳酶濃度選擇

固定蛋白粉濃度為5%，pH為2.0，溫度為38℃，酶添加量分別為 0.2%、0.5%、1.0%、2.0%，3.0%，反應4 h，其水解度見圖4。

由圖4可以看出，隨著酶濃度的增加，蛋白質的水解度逐漸增大。當酶濃度增加到1.0%時，蛋白質的水解度隨酶濃度的增加變化不大。因此，在工業化生產中，要綜合考慮水解度及生產成本之間的關系，為達到高水解度低成本，選用最適胃蛋白酶添加量為1%，其水解度可達15.90%。

2.5 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳水解時間的選擇

固定蛋白粉濃度為5%，酶濃度為0.2%，溫度為38 ℃，pH 為 2.0，在酶解時間為 1、2、3、4、5 h 期間，分別測其水解度，結果見圖5。

由圖5可以看出，蛋白質的水解度隨著水解時間的延長而增大。當水解時間達到4 h時，水解度隨著水解時間的增大而變化不大。因此，確定胃蛋白酶的最佳水解時間為4 h，此時胃蛋白酶水解蛋白粉的水解度為16.77%。

2.6 胃蛋白酶水解正交試驗

根據單因素試驗所得結果可知，溫度、底物濃度、酶濃度、酶解時間是影響水解度的主要因素，采用L9（34）的正交試驗，找出最佳試驗條件。正交試驗方案及結果如表1及表2所示。

表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

由表2可以看出：各因素對蛋白粉水解度影響的主次順序為A＞B＞C＞D，即溫度對蛋白粉的水解度影響最大，其次是底物濃度、酶濃度，酶解時間。根據k值可確定最優水平組合為A2B3C3D2，即最佳水解條件為：水解溫度為38℃，底物濃度為5%，酶濃度為2.0%，水解時間為4 h。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiments

2.7 驗證實驗

根據以上分析，進行如下驗證實驗，結果見表3。

表3 驗證實驗結果Table 3 Results of the confirmatory experiment

可以看出，實驗是穩定可靠的。經過驗證實驗，得到胃蛋白酶水解的最佳工藝條件，其條件為：水解溫度為38℃，底物濃度為5%，酶濃度為2.0%，水解時間為4h。此條件下蛋白粉的平均水解度可達15.76%。

2.8 雙酶水解蛋白粉

采用兩步水解法[7－8]。根據正交試驗的優化水解條件，先用胃蛋白酶在優化條件下先將蛋白粉水解至一定程度，測定水解度。再用胰蛋白酶繼續將部分水解的蛋白粉水解至不同程度，其他酶解條件為底物濃度6%、酶濃度0.5%、溫度55℃、pH為7.5、水解4 h。以考察胃蛋白酶—胰蛋白酶雙酶水解對水解效果的影響，其結果如表4所示。

由表4可知，由胃蛋白酶—胰蛋白酶組合酶水解蛋白粉，可以取得良好的水解效果，水解度明顯高于胃蛋白酶單酶水解。

表4 雙酶水解對水解效果的影響Table 4 The comparison results of double enzyme hydrolysis and single enzyme hydrolysis

3 結論

1）胃蛋白酶水解的最佳工藝條件：稱取5 g蛋白粉，加100 mL水勻漿，加1mol/L鹽酸調節pH為2.0，加入2 g胃蛋白酶，38℃條件下水解4 h后，95℃下滅酶10 min，此條件下平均水解度為15.76%。

2）胃蛋白酶—胰蛋白酶組合水解最佳工藝條件：在pH為2.0，溫度為38℃，底物濃度為6%的條件下，先加入濃度為2.0%的胃蛋白酶水解4 h，而后調節pH為7.5，溫度55℃，再加入濃度為0.5%的胰蛋白酶水解4 h，此時水解度高達20.41%。因此，胃蛋白酶—胰蛋白酶組合酶水解蛋白粉的水解效果明顯優于胃蛋白酶單酶水解。

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