二次酶解法提取硫酸軟骨素的工藝優化研究

陳亞，高鹽生

（江蘇省鹽城技師學院，江蘇省灘涂生物資源與環境保護重點建設實驗室，江蘇鹽城 224002）

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，簡稱 CS）是存在于動物軟骨組織中的多種酸性多糖的混合物，主要通過共價鍵與核心蛋白質相連，以蛋白聚糖的形式存在[1-2]。CS具有降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、調節免疫等多種藥理活性，在醫藥、保健食品、美容化妝品等領域應用廣泛[3]。作為我國重要的天然生化藥物資源，CS除了滿足國內市場需要外，還是我國生化藥物的第三大出口產品，僅次于氨基酸和肝素鈉，年出口總量達3 700 t。隨著各國對CS產品質量標準的提高，國際上對高純度CS的需求趨于旺盛，市場前景看好[4]。

目前，CS主要是從動物的軟骨組織中提取獲得，提取方法有堿法、堿鹽法、酶法、超聲波法和乙酸抽提法等，國內較多采用堿提—酶解—醇沉的方法制備CS[5]，該工藝中酶解的主要目的是利用蛋白酶水解蛋白質的特異性，使軟骨中的膠原蛋白和黏性蛋白等蛋白質水解成多肽或氨基酸，再根據氨基酸與CS在某些溶劑中的溶解性差異，實現CS與其它雜質的分離，從而提高CS的純度，因此酶解是CS提取中的關鍵環節，酶解效果直接關系到CS的得率和品質[6]。通常情況下，酶解工藝所用酶多為專一性較低的蛋白酶，比如胰酶[5，7]、木瓜蛋白酶[8]、堿性蛋白酶[9]等，但由于酶作用的特異性，導致其對蛋白質的水解不充分，產品純度不高。因而有學者采用由多種酶組成的復合酶對原料進行酶解以提高CS的提取效果[2，10]，但由于不同酶的最佳作用條件的差異，酶解工藝條件較難把握。本研究以豬喉軟骨為原料，通過堿提-酶解-醇沉的方法制備CS，并采用二次酶解法對酶解這一直接影響CS品質的關鍵步驟開展優化研究，為工業生產提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬喉軟骨：市售。

胰酶和中性蛋白酶：上海藍季科技發展有限公司；鹽酸氨基葡萄糖：南通雙林生物制品公司；其他試劑，國產分析純。

1.2 儀器與設備

FA1604型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；PHS-3C型實驗室pH計：上海精密科學儀器有限公司；722型可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水多用真空泵：鞏義予華儀器有限責任公司；KYC-100C空氣恒溫搖床：上海福瑪實驗設備有限公司。

1.3 提取工藝與方法

1.3.1 工藝流程

采用改進的堿提—酶解—醇沉的工藝流程：原料預處理→堿液提取→酶解Ⅰ（胰酶）→酶解Ⅱ（中性蛋白酶）→沉淀干燥→CS產品。與傳統工藝相比，本研究采用二次酶解的方法，即經胰酶水解后的產物再利用中性蛋白酶進一步酶解。

上述工藝中的原料預處理、去除雜質、沉淀干燥等實驗方法參考相關文獻[2，5]；堿液提取、酶解Ⅰ的工藝經前期的優化研究，堿液提取的最佳工藝為堿液濃度 10.0%、料液比 1∶1.6（g/mL）、提取時間 3.9 h、提取溫度40.0℃，胰酶酶解的最佳工藝為胰酶濃度1.0%、pH8.6、酶解溫度46℃、酶解時間2.8 h（詳細結果將另文報道）；本文重點對酶解Ⅱ環節進行優化研究。

1.3.2 中性蛋白酶酶解的工藝優化

胰酶酶解產物用2 mol/L的HCl調pH至7.0左右，加入中性蛋白酶進行二次酶解。根據影響酶促反應的因素，以CS純度和產率為分析指標，分別對酶解過程中的酶濃度、pH、酶解溫度、酶解時間進行單因素影響的實驗，篩選單因素的最佳條件。

1.3.3 產品檢測

CS產率計算：CS產率=提取的CS質量/供試豬軟骨質量×100%；

CS純度檢測，根據《中華人民共和國衛生部藥品標準》，以氨基葡萄糖含量為CS純度指標，采用Elson-Morgan法測定氨基葡萄糖含量[11]——樣品經鹽酸水解生成氨基葡萄糖，然后在堿性條件下與乙酸丙酮反應，生成色原物質，再與對二甲氨基苯甲醛反應產生紅色，以鹽酸氨基葡萄糖標準液為對照品，分光光度法測定其吸光度，進而換算出氨基葡萄糖含量[11-12]。

2 結果與分析

由于軟骨中的CS與蛋白質多糖結合成復合物，制備CS時，需通過酶將蛋白質水解成多肽或氨基酸，從而將CS釋放出來。但由于酶能水解的肽鍵有一定的特異性，釋放出的CS仍可能連接多個氨基酸殘基或多肽，在后續純化中很難除去。如用一步酶解法，CS含氮量難以降低，純度難以提高，所以為了提高CS的純度，可以選擇不同的酶進行二次酶解。本研究在傳統的堿提—酶解—醇沉工藝的基礎上，采用二次酶解法，以提高CS的提取效果，并在前期對堿液提取和第一步酶解工藝優化的基礎上，就中性蛋白酶的二次酶解工藝進行優化研究。

2.1 酶濃度的影響

為了探討不同中性蛋白酶濃度對產品產率及其氨基葡萄糖含量的影響，研究中分別采用濃度為0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%的中性蛋白酶溶液進行酶解，酶解溫度45℃、pH 7.0，酶解時間為2 h，結果如圖1所示。

由圖1可見，酶濃度對CS產率的影響不明顯；但對CS純度的影響較大，其氨基葡萄糖含量隨酶濃度的提高呈上升趨勢，在酶濃度1.1%時達到33.21%，此時的CS產率為17.51%。繼續提高酶濃度，氨基葡萄糖含量不再明顯上升。故1.1%為最佳的酶濃度。

2.2 酶解溫度的影響

選取酶濃度為1.1%，酶解溫度分別為40、42、44、46、48、50 ℃，pH 7.0，酶解時間為 2 h，考察酶解溫度的影響結果如圖2所示。

由圖2可知，CS產率在17.50%附近小幅變動，受酶解溫度的影響不明顯；而CS中氨基葡萄糖含量隨酶解溫度的上升先升高后下降，當酶解溫度為44℃時，氨基葡萄糖含量達最大值32.87%，此時的CS產率17.62%。所以44℃為最佳的酶解溫度。

2.3 pH的影響

采用酶濃度為1.1%，酶解溫度為44℃，分別選取pH 為 6.4、6.7、7.0、7.3、7.6、7.9，酶解時間為 2 h，考察pH對CS產率和氨基葡萄糖含量的影響，結果如圖3所示。

pH對氨基葡萄糖含量的影響較大，在所設計的試驗條件范圍內，氨基葡萄糖含量隨pH升高而明顯上升，在pH7.0時達到最大值，繼續增大pH，氨基葡萄糖含量迅速下降；而pH對CS產率影響不大。故7.0為最適pH，此時的氨基葡萄糖含量32.75%，CS產率17.71%。

2.4 酶解時間的影響

當酶濃度1.1%，酶解溫度44℃，pH7.0，酶解時間分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 時，考察酶解時間的影響，結果如圖4所示。在所設計的試驗條件范圍內，隨著酶解時間的延長，CS產率變化不明顯，而氨基葡萄糖含量緩慢上升，在酶解時間2.0h后，氨基葡萄糖含量不再明顯上升。故結合設備利用率、酶解成本等因素的考慮，選擇2.0h作為較好的酶解時間。

采用上述優化的酶解條件（酶濃度1.1%、酶解溫度44℃、pH7.0、酶解時間2.0 h），對經胰酶酶解的產物用中性蛋白酶進行二次酶解，產物經乙醇沉淀干燥，得到CS產品的產率為17.65%，其氨基葡萄糖含量達33.59%。與只經一次酶解比較，CS產率無明顯變化，但氨基葡萄糖含量提高了7.65%。表明二次酶解可以有效提高CS產品的純度和質量，滿足市場對高品質CS的需求。

3 結論

1）以新鮮豬喉軟骨為原料制備CS。在傳統的堿提—酶解—醇沉的基礎上，采用中性蛋白酶對原料進行二次酶解，并對其工藝條件進行優化研究，得到二次酶解的最佳條件為酶濃度1.1%、酶解溫度44℃、pH7.0、酶解時間 2.0 h。

2）研究結果表明，一次酶解得到的產物經二次酶解能增加CS中氨基葡萄糖含量7.65%，可以有效提高CS產品的純度和質量，滿足醫藥等領域對高品質CS的需求。

3）本研究對更好地利用生豬加工的副產品——豬喉軟骨，做到資源的合理和充分利用；以及為現有CS生產企業改進生產工藝，提高產品質量和經濟效益提供了參考。

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[1]戶業麗,蔡煥煥,程波,等.人工養殖鱘魚頭中硫酸軟骨素的提取工藝[J].食品研究與開發,2010,31(4):115-118

[2]吳楓楠.堿-酶法提取硫酸軟骨素的工藝研究[J].食品與生物技術學報,2010,20(1):81-83

[3]劉武.硫酸軟骨素藥理作用研究進展[J].中國藥業,2008,17(8):64-66

[4]張志斌.硫酸軟骨素生產新酶解法工藝[J].河南化工,2010,27(4):98

[5]許永安,陳守平,蘇金華,等.史氏鱘魚硫酸軟骨素的提取及抗腫瘤活性的研究[J].上海海洋大學學報,2010,19(4):553-559

[6]王安,劉靚,劉敏堯,等.硫酸軟骨素提取用酶的現狀及前景[J].食品研究與開發,2011,32(4):182-183

[7]徐傳屯,關瑞章,鄭江,等.養殖鱘魚軟骨中硫酸軟骨素的優化提取工藝研究[J].中國生化藥物雜志,2009,30(3):154-161

[8]熊雙麗,李安林,吳照民,等.雞胸軟骨硫酸軟骨素的提取及分離純化[J].農業工程學報,2009,25(1):271-275

[9]劉安軍,王慧,朱振元,等.鱘魚硫酸軟骨素提取工藝的研究[J].現代食品科技,2009,25(6):617-619

[10]舒坤賢,張繼承,袁帥,等.中華鱘硫酸軟骨素提取工藝研究[J].食品工業科技,2006,27(3):151-153

[11]中華人民共和國衛生部.WS-10001-(HD-0892)-98中華人民共和國衛生部藥品標準二部第六冊:生化藥品第一分冊[S].北京:化學工業出版社,1998:138-139

[12]伍茂云,謝書伸,冉蓉,等.硫酸軟骨素光度分析方法的改進[J].四川大學學報,工程科學版,2000,32(3):101-102