碧螺春茶提取物抗氧化活性研究

王桃云，沈雪林，錢瑋，顧華杰，胡翠英，朱安超

（1.蘇州科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009；2.蘇州市種子管理站，江蘇蘇州 215011）

抗氧化活性物質(zhì)可抑制自由基反應(yīng)，從而起到減少心血管疾病、減緩衰老和減少癌癥發(fā)生率等生理作用[1]。所以從天然產(chǎn)物中尋找安全和有效的抗氧化劑成為研究的熱點(diǎn)之一。

碧螺春茶葉原產(chǎn)于蘇州市洞庭東、西山，其“碧螺春”之名來(lái)自康熙御賜。碧螺春形美、色艷、香濃、味醇的特點(diǎn)使其成為我國(guó)的十大名茶之一。碧螺春茶葉中富含以茶多酚為主的抗氧化活性物質(zhì)，筆者通過(guò)研究在不同的抗氧化體系中碧螺春茶提取物的抗氧化特性，并與Vc和槲皮素的抗氧化性進(jìn)行比較，以期為碧螺春茶資源的深度開(kāi)發(fā)，合理利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槲皮素、亞油酸：Sigma公司，色譜純；抗壞血酸（VC）、二丁基羥基甲苯（BHT）、雙氧水、硫酸鐵、水楊酸、鄰苯三酚、三氯乙酸、沒(méi)食子酸、硫代巴比妥酸（TBA）、碘化鉀等：均為分析純。豬油：市售肥豬板油煎制；碧螺春茶葉：蘇州市吳中區(qū)西山碧螺春茶廠。

UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津儀器有限公司；MDF-u4086S型超低溫冰箱：日本三洋；N-1100S-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科儀。

1.2 方法

1.2.1 碧螺春茶提取物制備

將碧螺春茶烘干，粉碎過(guò)100目篩，稱取碧螺春干粉400 g，以1∶20料液比加入80%乙醇，60℃回流萃取兩次，每次3 h，5 000 r/min離心20 min，合并提取液。將所得提取液與等體積石油醚在分液漏斗中混勻分層，棄上相，所得下相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20 mL。將濃縮液置于超低溫冰箱中處理至完全凍結(jié)，然后用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24 h，將所得碧螺春茶提取物干粉用蒸餾水溶解，分別配成試驗(yàn)所需的不同濃度的溶液，備用。

1.2.2 EBT對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用[2-3]

利用H2O2對(duì)Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收。各試管中分別加入不同濃度的EBT（或VC、槲皮素）溶液 2 mL，9 mmol/L的水楊酸-乙醇 2 mL，9 mmol/LFeSO42 mL，最后加入8.8 mmol/LH2O2啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為空白對(duì)照，在510 nm下測(cè)量各濃度的吸光度。以水楊酸-乙醇2 mL，9 mmol/L FeSO42 mL，不同濃度的EBT（或VC、槲皮素）溶液2 mL為本底吸收。

·OH清除率的計(jì)算公式為：

清除率/%=[A0－（Ax－ Axo）]/A0× 100

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ax為加入提取物溶液后的吸光度；Axo為不加 H2O2、EBT（或 VC、槲皮素）溶液本底的吸光度。

1.2.3 EBT對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用[4-5]

將 EBT（或 VC、槲皮素）分別配成濃度為 2.0、5.0、8.0、11.0、14.0 μg/mL 的溶液。按表 1加樣于具塞比色皿中，迅速搖勻后每隔10 s用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在320 nm下測(cè)定相應(yīng)吸光度值，至吸光度值穩(wěn)定為止（10 mmol/L HCl溶液為參比）。清除率計(jì)算公式為：

清除率/%=（P0－ P）/P0× 100

式中：P0為鄰苯三酚的自氧化法速率，P為加入EBT（或VC、槲皮素）溶液后鄰苯三酚自氧化法速率，單位均為吸光度每分鐘的增值。

表1 鄰苯三酚試驗(yàn)加樣表Table 1 The dosages of the pyrogallol method

1.2.4 EBT對(duì)烷基自由基清除率的測(cè)定[6]

取2.5 mL 95%乙醇、2.5 mL 0.1 mol/L pH8.0磷酸緩沖液、0.05 mL亞油酸和0.5 mL EBT（或VC、槲皮素）樣品液，充分混合，用10 W紫外燈外光照射60 min，然后加入2 mL三氯乙酸（20%）和0.5 mL硫代巴比妥酸（3%），95℃水浴反應(yīng)90 min，冰浴冷卻，以5 000 r/min離心20 min，在532 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。空白組以等體積雙脫氧水代替EBT（或VC、槲皮素）樣品液。烷基自由基清除率的計(jì)算公式為：

清除率/%=（A0－Ai）/A0×100

式中：A0為空白的吸光度；Ai為加樣品液的吸光度。

1.2.5 EBT抑制油脂氧化效果測(cè)定[7]

油脂暴露在空氣中易氧化形成自由基，自由基與空氣中的氧反應(yīng)生成自由基和過(guò)氧化物，可以用油脂的POV值來(lái)評(píng)價(jià)其氧化程度，POV值越小，則油脂被氧化的程度越小。

稱取已測(cè)定POV的豬油4份，每份40.0 g置于250 mL的錐形瓶中，第1份加入6 mL乙醇作為空白對(duì)照，第2份加入 6 mL、0.5 mg/mL VC，第3份加入6 mL、0.5 mg/mL EBT，充分振搖后，置65℃恒溫干燥箱中，每隔24小時(shí)取2.0 g油樣測(cè)定POV值。每次取樣后充分振搖錐形瓶，以混入足夠的空氣。POV測(cè)定方法：按照動(dòng)植物油脂過(guò)氧化值測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T5538-2005）的方法測(cè)定。

過(guò)氧化值計(jì)算公式：

式中：V1是用于測(cè)定的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V0是用于測(cè)定豬油的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C 是硫代硫酸鈉標(biāo)定濃度，（mol/L）；M 是試樣的質(zhì)量，g。

2結(jié)果與分析

2.1 EBT對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用

按1.2.2所述方法，得不同濃度下EBT、Vc和槲皮素對(duì)·OH的清除率，如圖1所示。

由圖1可知，隨著EBT、槲皮素和Vc 3種物質(zhì)在反應(yīng)液中濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除率均呈上升趨勢(shì)。EBT對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用明顯高于槲皮素和Vc，在試驗(yàn)范圍內(nèi)其添加量與羥基自由基清除率呈正相關(guān)。EBT對(duì)羥基自由基的清除作用明顯優(yōu)于Vc和槲皮素。

2.2 EBT對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除作用

按1.2.3所述方法，得不同濃度下EBT、Vc和槲皮素對(duì)O2-·的清除率，如圖2所示。

由圖2可知，EBT、Vc和槲皮素對(duì)超氧陰離子自由基均有不同程度的清除作用，而且這3種抗氧化劑對(duì)超氧陰離子的清除作用隨其濃度的增加而增大。相同濃度下，Vc對(duì)O2－·清除效果最好，而EBT與槲皮素對(duì)超氧陰離子的清除作用基本相當(dāng)。

2.3 EBT對(duì)烷基自由基（R·）的清除作用

按1.2.4所述方法，得不同濃度下EBT、VC和槲皮素對(duì)烷基自由基的清除率，如圖3所示。

由圖3可知，EBT、槲皮素和Vc對(duì)烷基自由基有清除作用，且清除效果與添加的劑量正相關(guān)。EBT對(duì)烷基自由基的清除能力比槲皮素和Vc都強(qiáng)，槲皮素和Vc對(duì)烷基自由基的清除作用基本相當(dāng)。

2.4 EBT對(duì)油脂氧化的抑制作用

按1.2.5所述方法，得不同濃度下EBT和VC對(duì)油脂過(guò)氧化抑制作用效果，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在前5天內(nèi)，油脂氧化作用很弱，EBT和Vc對(duì)油脂過(guò)氧化也沒(méi)有明顯的抑制作用。從第6天開(kāi)始，EBT和Vc顯示出明顯的油脂氧化抑制作用，在開(kāi)始時(shí)，EBT和Vc對(duì)油脂氧化抑制作用相當(dāng)，但隨著處理時(shí)間加長(zhǎng)，EBT的油脂氧化抑制作用要明顯優(yōu)于Vc。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，碧螺春茶提取物具有較強(qiáng)的清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、烷基自由基以及抑制油脂過(guò)氧化的能力，清除率與樣品濃度呈正相關(guān)，這與碧螺春茶中所含多酚類和多糖類等活性物質(zhì)的種類有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了碧螺春茶具有較好的減少心血管疾病、減緩衰老等保健功能。碧螺春茶抗氧化的具體有效成分及分子機(jī)理有待更進(jìn)一步的研究。

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