奶粉基因組DNA不同提取方法的比較

徐偉麗，馬 鶯

(哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，150090哈爾濱)

近年來，分子生物學技術已成功用于物種鑒別，其中的聚合酶鏈式反應(PCR)技術更是廣泛應用于食品原料物種鑒別、飼料中動物源性成分的鑒別和摻偽檢驗.核酸分子是PCR技術應用的主要對象，所以，DNA的分離與提取是該項技術的重要前提［1-4］.反芻動物奶中含有體細胞(包括白細胞和乳腺上皮細胞).有研究表明，這些細胞可以作為DNA來源用于PCR擴增特定靶序列的區別動物物種［5-9］.目前，對于植物和動物組織全基因組DNA的提取方法已有不少研究和報道［10-19］.奶粉不同于一般的植物和動物組織材料，適宜的提取方法也不同.能夠更有效地提取更高質量的奶粉基因組DNA方法的篩選，是一個需要進一步探討的問題.

目前關于奶粉中全基因DNA的提取國外尚無報道，國內僅有岳巧云等［20］采用 Plant DNA Wizard純化試劑盒(Promega公司)提取奶粉中的基因組DNA用于實時熒光PCR法對奶粉中的豆粉進行檢測.此方法具有費用高、費時、對操作技能有較高要求等缺點，因此，需要發展簡單、快速、成本低的奶粉基因組DNA提取方法.而采用不同方法提取奶粉基因組DNA的比較研究目前國內外尚無報道.本實驗選擇熱解法、異丙醇沉淀法、CTAB(cetyl-trimethyl-ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法、SDS(sodium dodecyl sulphate，十二烷基硫酸鈉)法和高鹽低pH值法、異硫氰酸胍法6種方法，以市售奶粉為材料，進行基因組DNA提取，通過提取效果比較，探討適用于奶粉的基因組DNA提取方法.為乳品安全中利用PCR技術進行快速檢測找到簡單、穩定、優質的DNA提取方法.

1 實驗

1.1 實驗材料

全脂奶粉購于超市，于陰涼干燥處儲存備用.開封后分裝，于4℃保存.

1.2 試劑

Tris Base、EDTANa2、SDS、CTAB、異硫氰酸胍、Triton X-100、Tris平衡酚、瓊脂糖 G-10、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇及PCR試劑均購于哈爾濱寶泰克生物科技有限公司.

1.3 主要儀器

TGL-16G型臺式離心機、DK-80型電熱恒溫水槽、WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計、DYY-10型(ECP3000)三恒電泳儀、TAKARA TP600 PCR儀、Bio-RAD Universal HoodⅡ凝膠成像儀和電腦750 W微波爐均為本實驗室儀器.

1.4 引物

參照文獻［21］合成擴增牛12SrRNA基因設計特異性引物cow-1:5'-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAAT-CGATAA-3';cow-2:5'-AAATAGGGTTAGATGCACT-GAATCTAT-3'，擴增產物 344 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.

1.5 DNA提取方法

熱解法、異丙醇沉淀法、CTAB法、SDS法、高鹽低pH法、異硫氰酸胍法的具體步驟見文獻［1，3］.

1.6 基因組DNA純度和質量濃度檢測

［1，3］進行檢測.根據ρ(DNA)/(mg·L-1)=50×D(260nm)×501計算DNA質量濃度;根據D(260nm)/D(280nm)和D(260nm)/D(230nm)判斷DNA的大致純度.

1.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測

5μL 基因組 DNA與1μL6×Loading Buffer混勻，點樣，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳(100V，30min)，紫外凝膠成像儀觀察電泳膠板并拍照.

1.8 基因組DNA用于PCR擴增的適應性檢測

參考文獻［1-4］的反應體系和條件.用1.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物.

2 實驗結果

2.1 奶粉基因組DNA質量濃度和純度檢測結果

奶粉中基因組DNA的提取結果見表1.可以看出:DNA質量濃度最大的為SDS法(495.833mg/L);其次為異丙醇沉淀法和熱解法，分別為302.083和231.250mg/L.高鹽低pH法和CTAB法提取的DNA質量濃度最低，分別為31.250和29.167 mg/L.提取得到的DNA的D(260nm)/D(280nm)范圍為1.65～1.87，較為理想;若偏高，表明有RNA污染;若偏低，則表明有蛋白或苯酚污染，接近1.80效果最好［22-23］.表中數據也表明CTAB法和異丙醇沉淀法提取的基因組DNA的純度較高，其他4種方法均較低.因此，也不能排除由于雜質的影響而使DNA質量濃度的測量結果偏大的可能.

表1 奶粉基因組DNA的質量濃度和純度

2.2 奶粉基因組DNA的瓊脂糖電泳檢測結果

奶粉基因組DNA的質量濃度和純度進一步采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果見圖1.CTAB法提取的奶粉基因組DNA譜帶單一，無碎片和連片;重復試驗的DNA條帶遷移率一致，說明此方法具有較好的穩定性以及此法提取的基因組DNA完整性好.其他5種方法提取的基因組DNA在凝膠上沒有出現譜帶，其可能原因:一是DNA質量濃度較低;二是沒有提取到DNA.

2.3 PCR擴增結果

奶粉基因組DNA的PCR反應結果見圖2.結果顯示，PCR產物的量不取決于DNA的質量濃度，而是取決于DNA的提取方法.異丙醇沉淀法和SDS法提取的DNA質量濃度較高，卻不能得到滿意的PCR擴增產物.其他4種方法提取的基因組DNA樣品的PCR擴增片段大小與預期一致，且重復性好.說明這4種方法提取的基因組DNA可以直接用于牛特異性片段的PCR擴增.因此，認為這4種方法提取的奶粉基因組DNA均適用于PCR檢測.其中熱解法和CTAB法特異性條帶更清晰，效果更好.

圖1 奶粉基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2 牛特異性引物擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

PCR技術以及建立在PCR基礎上的分子標記技術，能以微觀的視角解釋其他技術現在無法解決的問題.但是，由于PCR擴增對模板DNA的質量要求較高，DNA質量是影響分子實驗結果的關鍵因素之一［1-4，18-19］.

在提取奶粉基因組DNA的過程中要注意:奶粉開封后陰涼干燥處保存，避免雜菌污染和吸濕結塊;奶粉在進行去蛋白步驟時，顛倒混勻要充分(保持一段時間)，以增加抽提效果;水浴加熱時要使管蓋高出水面并保持一定的高度，避免Eppordorf管炸開，污染樣品.

4 結論

1)奶粉中的DNA含量很少，這6種方法獲得的提取物中均有蛋白質污染.

2)熱解法、CTAB法、高鹽低pH法和異硫氰酸胍法提取的奶粉基因組DNA均適用于PCR檢測.綜合考慮基因組DNA的純度和質量濃度，認為這4種方法的優劣依次為:熱解法、異硫氰酸胍法、高鹽低pH法和CTAB法.

3)這4種奶粉基因組DNA提取方法均具有操作簡便、省時、利于快速檢測等優點.可以根據具體的實驗條件和要求選擇相應的DNA提取方法.

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