微生物非培養技術在環境污染控制領域的應用

馬 放，蔡 蕊，李 昂，崔 迪，王繼華，龐長瀧，邱 天，楊基先

(1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，150090哈爾濱;3.哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，150025哈爾濱)

復雜多變的自然環境造就了微生物的多樣性，包括代謝多樣性、結構多樣性、行為多樣性、生態多樣性和進化多樣性等.傳統的純培養技術對不同生境微生物的可培養性較低，99%以上的微生物的多樣性由于不可培養而丟失［1］，因此，純培養技術的局限性成為了研究微生物多樣性的瓶頸.微生物非培養技術，避開了純培養的微生物分離方法，即運用分子生物學手段從DNA水平上研究未培養微生物的多樣性及微生物群落動態變化、相對豐度及分布，檢測微生物群落對人為干擾的承載能力［2］.微生物非培養技術包括DNA指紋技術、分子雜交、生物芯片、基因組學以及宏基因組學、宏轉錄組學等“組學”技術，這些技術已經應用到非培養微生物的生理特性及群落組成、結構變化研究，對污染區域的環境樣品進行基因組測序，開發新的菌種、功能基因以及微生物資源等各個領域中.

生物修復技術主要是利用一種或多種微生物特有的分解有毒有害物質的能力，去除受污染環境中異生型化合物或人工合成的化合物，使其濃度降低或完全無害化.在利用生物修復技術治理污染區域的過程中，土著微生物及生物強化后的微生物群落結構、功能、代謝及動力學等是影響生物修復效能的主要因素.微生物非培養技術的發展為揭示生物修復區域中微生物群落結構及功能提供了強有力的工具，本文主要介紹微生物非培養技術在環境污染控制領域的研究進展.

1 環境樣品中DNA、RNA和蛋白質的提取方法

1.1 環境樣品中DNA、RNA的提取

提取DNA、RNA遵循的原則是首先保證核酸一級結構的完整性，其次要將蛋白質、糖類、脂類含量降低到最低程度并排除腐殖酸、富里酸和大量與DNA、RNA共沉淀的其他有機污染物、重金屬及化學雜質對分子多樣性分析產生的干擾.提取的DNA和RNA的產量及純度主要取決于存在的雜質類型、樣品來源和提取過程中使用的試劑.傳統的DNA提取方法見表1.從環境樣品中直接提取RNA的方法與提取DNA的方法相似，RNA的穩定性較差，易被RNA酶(RNase)切割水解，提取時需十分小心，實驗用品也要進行嚴格的消毒滅菌，預防RNase污染.目前常用的RNA提取方法見表2.市售的FastDNA和FastRNA試劑盒、FastPrep、UltraCleanTM等工具也廣泛應用于DNA、RNA的提取.

1.2 環境樣品中蛋白質的提取

根據不同原理，蛋白質的提取主要分為兩類:一是利用不同組分分配率的差別進行提取，如結晶、有機溶劑提取、鹽析和層析等方法;二是將混合物置于單一物相中，通過物理作用將不同組分分離，如超速離心、電泳、超濾等.蛋白質易失活，在提純過程中要注意溫度、酸堿緩沖條件、水的純度、洗滌劑等因素對蛋白質的影響.常用的蛋白質分離方法見表3.

表1 傳統的DNA提取方法

表2 常用的RNA提取方法

表3 常用的蛋白質分離方法

2 基于16SrDNA的微生物指紋技術

基于16SrDNA的微生物指紋技術是一種用于分析污染區域中微生物基因多樣性和揭示微生物群落組成、活性及功能變化的非培養技術.以聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術為基礎，具有較高的精確性和穩定性，主要包括以下幾種技術.變性/溫度梯度凝膠電泳(Denaturing/Temperature Gradient Gel Electorphoresis，DGGE/TGGE)依據的原理是利用含有50 bp GC夾的引物、基于變性梯度發生化學或溫度變化的聚丙烯酰胺凝膠的分離產物，從群落DNA中擴增rRNA或功能基因PCR產物［3］.Li等利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳指紋技術(Polymerase Chain Reaction-DenaturingGradientGel Electorphoresis，PCR-DGGE)解析了受金屬污染的土壤中微生物群落變化，探究了金屬沉積物的污染區域中dsrB基因(異化的亞硫酸鹽還原酶β-亞基)的豐度［4］.自動核糖體基因間隔序列分析(Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis，ARISA)是依據自動測序系統中，對rRNA基因間隔轉錄空間(Intergenic Transcribed Spacer，ITS)擴增產物的分離和檢測，由熒光標記引物對微生物群落DNA進行ITS擴增［3］.Qu利用ARISA技術研究膜生物反應器中溴氨酸廢水的微生物種群的動態變化［5］.長度異質性聚合酶鏈反應(Length Heterogeneity PCR，LH-PCR)是一種檢測微生物群落中不同小亞基(Small Subunit，SSU)rRNA基因長度自然變化的方法.Connon通過此方法確定了受三氯乙烯污染的地下水樣品在丙烷持續的刺激下細菌群落的組成變化［6］.單鏈構象多態性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)方法即在非變性條件下分析單鏈rRNA基因的電泳遷移率，得到組合帶型，區分出不同的微生物發育組群.Kiesel利用SSCP技術檢測地下水樣品在無氧條件下持續氯苯降解過程中微生物群落的改變［7］.末端限制性片段長度多態性分析(Terminal-RestrictionFragmentLengthPolymorphism，T-RFLP)技術是近十年引入微生物生態研究中的，此技術的主要優勢是簡便、自動化、可對計算機模擬的數據進行精確分析.T-RFLP分析即利用熒光標記的引物，從微生物群落總DNA中擴增SSU rRNA基因后酶切擴增產物，產生 TRFs，由毛細管電泳進行分離.每個單獨的T-RF對應唯一一個微生物發育系統或一個操作分類單元的群落指紋.然后利用自動DNA測序儀器檢測T-RFs的大小和相對豐度.此外，還有擴增核糖體DNA限制性酶切分析技術(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA)、隨機擴增多態性DNA分析(Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis，RAPD)、擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphisms，AFLP)分析、核糖體基因區間序列分析 (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis，RISA)等技術.

3 基于功能基因的微生物指紋技術

基于功能基因的微生物指紋技術是由DNA指紋技術衍生而來.Pieper研究小組利用擴增功能DNA限制性酶切分析 (Amplified Functional DNA Restriction Analysis，AFDRA)對土壤微生物菌群的功能基因 (C23O基因)遺傳多樣性進行了實時監測，揭示了土壤中功能基因的多態性及動態變化［8-9］.目前在微生物群落分析中應用較多的功能基因包括氨單加氧酶基因 (amoA)，反硝化代謝途徑中的一系列基因 (narG、nirK、nirS及nosZ)及苯酚羥化酶大亞基基因 (LmPH)等［10-12］.在許多情況下，用功能基因進行分類的分辨率能夠達到比種更低的水平，這是由功能基因序列在進化上的低保守性和較高的進化速率決定的.

4 其他非培養技術

4.1 熒光原位雜交技術(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)

FISH技術是一種由靶目標rRNA熒光染料標記的寡核苷酸探針與附著于膜過濾器或玻璃片上通透的微生物細胞核糖體的選擇性雜交過程.微生物細胞被靶目標rRNA探針染色，通過熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM)或流式細胞儀技術將其可視化或計數［13］.在FISH中，可應用以原核和真核微生物類群為目標的多組特定rRNA探針，實現環境樣品中微生物種群的同步系統發育分類和定量化.傳統的FISH技術具有一定的局限性，為此研發了兩種新的組合方法，即催化報導沉積的熒光原位雜交技術(Catalyzed Reporter Deposition-Fluorescence In Situ Hybridization，CARD-FISH)和熒光原位雜交微生物放射自顯影技術(Fluorescence In Situ Hybridization-Microautoradiography，FISH-MAR).

4.2 穩定性同位素標記(Stable Isotope Probing，SIP)技術

穩定性同位素標記(SIP)是一種新型方法，直接將微生物群落及其功能聯系起來，不需單獨培養微生物，彌補了分子指紋技術和測序方法的不足.SIP技術是通過等密度梯度超速離心的方法為微生物群落及其核酸總細胞庫的分離提供重同位素標記底物(如13C標記的底物)［14］.提取出的總核酸會形成兩個不同的離心分離區，分別用13C(高浮力密度)和12C標記(含核酸片段的低浮力密度).利用分子技術將被重同位素標記的功能性微生物群落從組合的13C標記的核酸片段中分離出來.天然的含核酸片段的12C標記物在SIP實驗中通常作為陰極控制，來區分活躍的(13C標記的)和不活躍的(含12C)微生物種群.Singleton等將13C標記的萘、13C標記的水楊酸和菲加入受PAH污染的土壤中，來鑒定群落DNA中降解 PAHs的菌種［15］.

4.3 分子生物傳感器

環境生物傳感器是利用高靈敏性的生物意識過程(信號)來測定特定化合物(污染物)與生物系統的相互作用，在污染物的監控方面取得了顯著成果.分子傳感器是由重組的質粒作為生物元件，并有一個啟動子，對目標分子敏感，通過報告系統產生信號.啟動子可隨特定的分子開啟或關閉，在信號產生方面具有專一性.在微生物生態學方面應用的生物傳感器大多是基因工程生物，其反應啟動子與相應的報告基因融合，包括適合β-半乳糖苷酶的lacZ基因編碼、熒光素酶系統的lux基因、綠色熒光蛋白(GFP)的gfp基因以及冰核蛋白質的inaZ基因等［16］.

4.4 DNA微陣列

DNA微陣列即用金屬針(接觸印跡)或墨水噴射(非接觸印跡)的方法將探針儲存或固定在玻璃表面.根據靶目標DNA分子(單細胞基因或群落基因)與排列探針的雜交，將每個靶目標探針雜交位點的熒光信號與本底值信號噪聲比有關的每個信號位點的平均信號強度，設計成定量檢測，并由商業化的圖像分析軟件測定［17］.DNA微陣列可用于復雜生態系統中微生物種群的快速、靈敏、定量化及同步監控.根據微陣列使用探針的不同可分為幾種類型.其中，系統發育寡核苷酸陣列(Phylogenetic Oligonucleotide Arrays，POA)、功能基因陣列(Functional Gene Arrays，FGA)和全基因陣列(Whole Genome Arrays，WGA)是生物修復研究中最常用的方法.

4.5 實時定量聚合酶鏈反應(Real-time Quan-titative PCR，qPCR)技術

實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)用于解析微生物群落變化或監控生態修復過程中物質的分解代謝活性，是依據對每個擴增循環中分子的熒光性隨PCR產物的積累而增強進行的實時檢測.需要使用校對工具在數據庫序列中進行比對來設計探針和引物，從而找到專門對應一種微生物或一個分解代謝基因的特征序列.Nyyssonen等證實了靈敏的實時PCR檢測技術可對土壤樣品中萘降解菌的萘-羥基化雙加氧酶(nahAc)基因進行定量化分析，并監測萘的生物降解過程，對土壤漿液微觀環境下的萘雙加氧酶基因計數［18］.

5 宏基因組學技術

5.1 宏基因組學技術概述

宏基因組學技術這一概念是基于環境微生物(基因組學)中基因同步分析和環境樣品(宏基因組學)中所有微生物基因分析提出的，突破了純培養方面的一些限制.1991年，Pace等首次提出環境基因組學(Environmental genomics)的概念，并利用構建的宏基因組文庫篩選出15種新的菌種［19］.1998 年，Handelsman 等提出以環境樣品中微生物群體基因組為研究對象，通過序列和功能基因的篩選方式建立宏基因組文庫，定義了宏基因組(Metagenome)，即特定生境下全部微生物遺傳物質的總和［20］.目前宏基因組學技術已廣泛應用到海洋、土壤、人體腸道等多種環境中微生物多樣性研究、特定功能基因篩選和新物種開發等.

5.2 宏基因組文庫

宏基因組文庫是用一個適宜的載體(如質粒，噬菌體，福斯質粒，柯斯質粒或細菌人工染色體BAC)將環境樣品中提取DNA片段直接克隆，轉移至合適的宿主菌株，并通過測序等篩選程序來分析克隆的DNA片段，確定具有特定功能的基因.宏基因組文庫資源豐富且復雜，需采用高靈敏度和高通量的方法對有用的基因進行篩選和鑒定，目前常用的篩選技術如表 4［21-22］.Martin 構建了宏基因文庫，通過確定全基因和優勢菌群聚磷菌Candidatus Accumulibacter phosphatis中參與磷累積的基因，探究了生物除磷系統中微生物群落及其代謝功能，揭示出除磷的原因［23］.Suenaga從污泥樣品中獲取宏基因組DNA片段并構建了福斯質粒文庫，使用鄰苯二酚作為底物，產生了91個EDO陽極克隆，篩選出雌二醇雙加氧酶(EDOs)［24］.吳杰構建了澳大利亞厚皮海綿的Fosmid宏基因組文庫，是我國首次嘗試用海綿豐富的基因資源研究宏基因組學［25］.

表4 常用的宏基因組文庫篩選方法

5.3 宏基因組測序

宏基因組測序即對環境中提取的總DNA進行全基因組測序，避免了傳統微生物純培養技術的弊端，提升了微生物資源可利用的空間.該技術的產生和發展極大程度地揭示了環境樣品中微生物群落中微生物多樣性、功能多樣性及代謝多樣性，是評估環境樣品中微生物組成結構的最精確方法之一.到目前為止，已經有210多個不同環境，包括海洋、土壤、活性污泥及人體腸道等宏基因組樣品被測序［26］.我國華大基因的研究者對人類腸道微生物進行了宏基因組測序，揭示了腸道微生物群落的結構、代謝及功能基因等信息，并以封面文章的形式發表與Nature雜志上［27］.在宏基因組學領域的另一項創新技術是大規模平行焦磷酸測序，也稱為宏基因組焦磷酸測序.目前常用的是Roche 454 GS-FLX Titanium高通量測序系統，可同時對30多萬個序列進行大規模平行焦磷酸測序，具有高讀長、成本低、精度高、無偏性等優點.

6 宏轉錄組學技術

6.1 轉錄組學和宏轉錄組學

宏轉錄組學即通過直接提取環境微生物群落mRNA，研究環境樣品中微生物的物化、生物活性來獲得全體微生物群落基因表達情況的技術.宏轉錄組學分析的基本步驟為:總mRNA的提取和擴充;cDNA合成;cDNA微陣列雜交或完整cDNA轉錄測序.

6.2 宏轉錄組測序

與宏基因組測序技術相比，宏轉錄組測序能夠反映出微生物群落在特定條件下的基因表達情況，準確揭示群落真實的代謝活性.將宏轉錄組學與焦磷酸測序或cDNA微陣列結合使用，成為檢測微生物群落轉錄活動的有利工具.Urich等利用環境轉錄組學方法，首先提取出微生物群落總RNA，隨機反轉錄成cDNA，將焦磷酸測序結果進行拼接注釋后，發現193 219個與微生物分類相關的rRNA序列及21 133個與土壤微生物功能性相關的基因［28］.

7 宏蛋白質組學技術

1994年，Wilkins等提出了蛋白質組的概念，指一個基因組所表達的所有蛋白質，或細胞、組織、機體在特定時空所表達的全部蛋白質［29］.2004年，Rodriguez-Valera在蛋白質組和宏基因組基礎上提出了宏蛋白質組(Metaproteomics)這一概念，即在一定條件下對微生物群落所有蛋白質的組成進行實時大規模的鑒定［30］.宏蛋白質組學是繼宏基因組學之后在環境微生物學科中出現的又一新的研究方向，即從復雜的環境樣品中總蛋白的水平，對不同物種間相互作用及整個微生物群落組成、功能等進行深入研究，進而掌握不同時空內的基因表達情況.目前常采用兩種研究路線:一是采用雙向電泳、生物質譜聯合的方法研究微生物群落中蛋白質的表達情況，二是采用多維色譜、生物質譜結合的方法，即鳥槍法［31］.Wilmes等對具有生物除磷功能的活性污泥系統展開了宏蛋白質組學的研究，探究了好氧/厭氧處理過程中微生物表達蛋白質的情況以及微生物的轉變對除磷效果的影響，鑒定出與生物除磷相關的蛋白［32］.Kim等使用二維凝膠電泳的方法探究了可降解高相對分子質量多環芳烴(HMW-PAHs)的菌株PYR-1誘導產生的蛋白質，包括過氧化氫酶-過氧化物酶、假定單加氧酶等［33］.利用2DE/MS和標記裂解同位素聯合蛋白質組學方法分析了惡臭假單胞菌KT2440中芳香烴的分解途徑［34］.Benndorf等對 2，4 二氯苯氧基乙酸(2，4-D)污染的土壤和氯苯污染的地下水中微生物群落進行了功能性宏蛋白質組學分析［35］.

8 微生物代謝組學

除了宏基因組學、宏轉錄組學和宏蛋白質組學外，對微生物細胞內細胞代謝物全部功能的整體分析也是研究的重點，這一方向稱為代謝組學.當面對環境挑戰或壓力時，微生物細胞會釋放低相對分子質量的初級和次級代謝物.代謝組學是應用分離和分析技術對微生物細胞內的這些代謝產物進行功能角色的量化.微生物代謝組學包含幾種代謝方法，如代謝指紋和足紋法、代謝構造和靶目標分析，來確定和量化細胞代謝產物［36］.Keum等在菲降解過程中對根瘤菌C4進行了相對代謝組學分析，研究了極性代謝物、脂肪酸和聚羥基脂肪酸酯等物質［37］.對一段時間內一個細胞中細胞分子/代謝物的實時通量分析稱為代謝通量組學.Tang等通過GC-MS和數據、生化及基因算法對希瓦氏菌藻進行了代謝組學分析，此菌對金屬、放射性核素和鹵化有機化合物的生物修復有共代謝途徑，得出當希瓦氏菌藻適應不同碳源時可表現出相對靈活的代謝通量的結論［38］.

9 未來前景

不可培養微生物在新陳代謝途徑、物種、生理生化反應、產物等各方面都具有豐富的多樣性和新穎性，與可培養微生物相比，具有更廣闊的微生物資源利用前景.微生物非培養技術為不可培養微生物的研究提供了有利手段，尤其是宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白質組學等“組學”技術的發展與應用，對不可培養微生物資源的開發利用發揮了越來越重要的作用.宏基因組學提供了環境樣品中總DNA的信息，宏轉錄組學反映了環境基因實時表達情況，宏蛋白質組學揭示了實時狀況下環境微生物功能的變化，而代謝組學提供最后的環境代謝產物的總體信息，各種“組學”技術分別從不同水平對環境微生物的組成、結構及功能等進行了全面的描述，對研究功能基因多樣性、了解微生物群落活性及其對生態系統功能的影響起到了推動作用.從基因水平到代謝產物的研究，各種非培養技術有機的結合，形成一個完整、合理的研究體系，必將在環境微生物生態領域的研究中發揮越來越大的作用.

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