λpL/pR-cI857溫控系統的改造及其對大腸桿菌菌蛻制備的影響

董洪亮，韓先干，白灝，何亮，劉蕾，劉瑞，柴同杰，丁鏟，劉海文，于圣青

1 山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 2710002 中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241

λpL/pR-cI857溫控系統的改造及其對大腸桿菌菌蛻制備的影響

董洪亮1,2，韓先干2，白灝2，何亮2，劉蕾2，劉瑞2，柴同杰1，丁鏟2，劉海文2，于圣青2

1 山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271000
2 中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241

董洪亮, 韓先干, 白灝, 等. λpL/pR-cI857溫控系統的改造及其對大腸桿菌菌蛻制備的影響. 生物工程學報, 2012,28(12): 1423?1430.

Dong HL, Han XG, Bai H, et al. Mutation of λpL/pR-cI857 system for production of bacterial ghost inEscherichia coli. Chin J Biotech, 2012, 28(12): 1423?1430.

菌蛻是革蘭氏陰性菌在噬菌體Phix174的溶菌基因E的作用下形成的細菌空殼，通常由λpL/pR-cI857溫控系統通過調控E基因的表達制備。通過重疊PCR技術，將λpL/pR-cI857溫控系統中λpR啟動子的第2個操縱基因 (OR2) 的第9位堿基由T突變為C (T→C)。溶菌試驗結果表明，突變后的λpL/pR-cI857系統在37 ℃時仍能穩定抑制基因E的表達，對大腸桿菌的溶菌率為99.9%。通過對λpR啟動子的改造，擴大了λpL/pR-cI857溫控系統的溫度調控范圍，為菌蛻疫苗的研制提供了參考。

大腸桿菌，菌蛻，重疊PCR，突變

菌蛻 (Bacterial ghost) 是通過PhiX174噬菌體溶菌基因E的可調控表達而形成的缺少細胞漿和核酸且無繁殖能力的革蘭氏陰性細菌空殼[1]。溶菌基因E編碼91個氨基酸的疏水蛋白，它能在革蘭氏陰性細菌細胞膜上形成一個直徑約為40～200 nm的特異性的跨膜孔道，在滲透壓的作用下使革蘭氏陰性細菌的胞質內含物由孔道排出，從而形成不含核酸、核糖體及其他組分的細菌空殼[2-6]。菌蛻作為一種新型的疫苗，與傳統的滅活疫苗相比，菌蛻保持了細菌原有的細胞形態、細菌表面抗原結構和黏附性等特性，因而能誘導機體產生更強的體液免疫、細胞免疫以及黏膜免疫[7-10]。

通常用 λpL/pR-cI857溫控制系統控制溶菌基因E的表達來制備菌蛻。這一溫控系統在高于30 ℃時，阻遏蛋白cI857因熱失活，并引起E基因的表達，在42 ℃時達到最佳的細菌溶菌效果[11]。但在菌蛻制備過程中存在兩點不足，一是溶菌前細菌需要在30 ℃以下進行培養，不利于細菌的大量生產。二是溫度由 30 ℃突然轉為42 ℃時，熱沖擊容易對抗原決定簇結構造成影響。本實驗通過定點突變技術，使λpR啟動子的第2個操縱基因 (OR2) 的第9位堿基由T突變為C (T→C)，突變后的λpL/pR-cI857系統在37 ℃時仍能穩定抑制基因 E的表達，而當溫度達到39 ℃～42 ℃時開始誘導溶菌。本研究通過對λpL/pR-cI857系統的優化，成功解決菌蛻制備過程中存在的不足，為進一步研究菌蛻疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株及試劑

pUC19-cI857-E-rrnB溶菌質粒由本實驗室構建保存[12]。大腸桿菌DH5α感受態細胞購自天根生物技術有限公司，鴨源禽致病性大腸桿菌DE17株由本實驗室分離保存[13]。

限制性內切酶SphⅠ和PstⅠ購自寶生物技術有限公司。普通質粒小提試劑盒購自天根生物技術有限公司。GenJETTMPCR Extraction Kit購自 Fermentas。2×TaqPCR Master Mix，DNA Ligation Kit，DNA marker 5000以及pUC19載體購自TaKaRa公司。

1.2 溶菌表達盒cI857-E-rrnB的擴增

用引物cI857-F/rrnB-R (表1) 擴增溶菌質粒pUC19-cI857-E-rrnB中長度為1 589 bp的溶菌表達盒cI857-E-rrnB。

1.3 溶菌表達盒的點突變

cI857-E-rrnB溶菌表達盒中的λpR啟動子有3個操縱基因 (ORs)，其中第 2個操縱基因(OR2) 序列為 5′-TAACACCGTGCGTGTTG-3′[14]。對其第9位點進行定點突變 (圖1)。

以本實驗室構建的 pUC19-cI857-E-rrnB為模板，以cI857-F/cI857-mutR為引物擴增大小為783 bp的ΔcI857-E片段，以cI857-mutF/rrnB-R為引物擴增大小為806 bp的ΔcI857-rrnB片段。PCR產物用GenJETTMPCR Extraction Kit試劑盒回收。以回收的 ΔcI857-E (模板 1) 片段和ΔcI857-rrnB (模板2) 片段同時作為模板，用引物cI857-F/rrnB-R擴增大小為 1 589 bp的 ΔcI857-E-rrnB片段。PCR的反應條件為：95 5℃ min；98 10℃ s，55 5℃ s，72 2℃ min，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA凝膠回收試劑盒回收。

1.4 溶菌表達質粒的構建

用限制性內切酶SphⅠ和PstⅠ對純化的ΔcI857-E-rrnB片段和pUC19載體進行酶切、連接后，轉化大腸桿菌DH5α，用含100 μg/mL Amp的LB固體培養基進行篩選。將PCR鑒定為陽性的克隆，轉接到含100 μg/mL Amp的LB液體培養基，提取質粒進行酶切、測序鑒定，陽性質粒命名為pUC19-ΔcI857-E-rrnB。

表1 本研究中PCR擴增所用引物序列Table 1 Primer sequence for PCR amplification in this study

圖1 點突變示意圖Fig. 1 Operator/promoter sequence of the mutated rightward λpR promoter.

1.5 溶菌實驗

將質粒 pUC19-cI857-E-rrnB、pUC19-ΔcI857-E-rrnB以及pUC19分別轉化大腸桿菌DH5α中，并將質粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB轉化本實驗室分離的禽致病性大腸桿菌DE17中，挑取上述轉化中的陽性克隆，分別在 28 ℃和 37 ℃培養至OD600=0.4后，轉至42 ℃培養，每隔20 min取100 μL菌液測其OD600，繪制溶菌曲線。

分別取上述42 ℃誘導0 h和4 h后的菌液100 μL，10倍稀釋后，接種到含 100 μg/mL Amp的 LB固體培養基上。培養過夜后進行活菌計數，每個稀釋度3個重復。計算細菌溶菌效率，計算公式為：溶菌率=(1?誘導后 CFU/誘導前CFU) ×100%。

2 結果

2.1 溶菌質粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB的構建

以cI857-F/cI857-mutR為引物，成功擴增大小為 783 bp的 ΔcI857-E片段 (圖 2，泳道 1)，以 cI857-mutF/rrnB-R為引物，成功擴增大小為806 bp 的 ΔcI857-rrnB (圖 2，泳道 3)，以cI857-F/rrnB-R為引物，運用重疊PCR技術，成功擴增大小為 1 589 bp的溶菌表達盒ΔcI857-E-rrnB片段 (圖2，泳道5)。

對構建的溶菌質粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB進行雙酶切鑒定，結果在預期位置 (1 589 bp處)出現目的條帶，表明溶菌表達盒 ΔcI857-E-rrnB成功克隆至pUC19 (圖3)。

對pUC19-ΔcI857-E-rrnB的測序結果表明，λpR啟動子中操縱基因的OR2 的第9位堿基成功地由T誘變為C (T→C) (圖4)。

圖2 PCR擴增ΔcI857-E-rrnBFig. 2 PCR amplification of ΔcI857-E-rrnB. M: DNA marker DL-2000; 1: PCR product of ΔcI857-E; 3: PCR product of ΔcI857-rrnB; 5: PCR product of ΔcI857-E-rrnB; 2,4,6: negative control.

圖3 pUC19-ΔcI857-E-rrnB雙酶切鑒定Fig. 3 Degestion analysis of plasmid pUC19-ΔcI857-E-rrnB. M: DNA marker DL-5000; 1: pUC19-ΔcI857-E-rrnB digested with Sph I and Pst I; 2: PCR product of ΔcI857-E-rrnB.

2.2 大腸桿菌溶菌動力學比較

轉化溶菌質粒pUC19-cI857-E-rrnB和pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α在28 ℃培養至OD600值約為0.4后，轉入42 ℃培養80 min后DH5α的OD600值均達到約0.9，隨后開始下降，培養200 min后，OD600值降至約0.2后保持不變。而含有pUC19的大腸桿菌DH5α的OD600值一直增加約1.3后，維持不變 (圖5)。

轉化溶菌質粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α和禽致病性大腸桿菌DE17，在37 ℃培養至OD600值約為0.4后，轉入42 ℃培養，其OD600值均持續增大，60 min后，OD600達到約1.0，隨后開始下降，培養200 min后，OD600值降至約 0.7后保持不變。而轉化溶菌質粒pUC19-cI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，在37 ℃培養直至OD600值約為0.4后，轉入42 ℃培養，OD600值在60 min后達到約0.6，隨后一直維持穩定 (圖6)。轉化質粒pUC19的大腸桿菌DH5α，其OD600值在從37 ℃轉為42 ℃后，一直上升直至達到平臺期 (OD600=1.3)。

圖4 點突變測序圖譜Fig. 4 Mutated identification by DNA sequencing.

圖5 大腸桿菌溶菌動力學曲線 (28 ℃培養)Fig. 5 Growth and lysis curves of bacteria (28 ℃).

2.3 不同誘導溫度對溶菌率的影響

轉化溶菌質粒pUC19-cI857-E-rrnB和pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，在28 ℃培養至OD600值為0.4，轉入42 ℃誘導4 h后，溶菌率都可達到99.95%。

轉化溶菌質粒pUC19-cI857-E-rrnB和pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，在37 ℃培養至OD600值為0.4，轉入42 ℃誘導4 h后，溶菌率分別為61.53%和99.94%。

轉化溶菌質粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB的禽致病性大腸桿菌DE17，在37 ℃培養至OD600值為0.4，轉入42 ℃誘導4 h后，溶菌率為99.93% (表2)。

圖6 大腸桿菌溶菌動力學曲線 (37 ℃培養)Fig. 6 Growth and lysis curves of bacteria (37 ℃).

表2 不同溫度對溶菌質粒溶菌效率的比較Table 2 Comparison of the efficiency of bacterial lysates

3 討論

與常規疫苗相比，菌蛻具有與活菌相同功能的膜抗原結構，可誘導機體同時產生體液免疫和細胞免疫。此外，菌蛻成本低廉，易于大規模生產，且制成的凍干苗在室溫下即可長時間保存，免疫時也無需加入佐劑，因其本身就具有佐劑的性質。包括大腸桿菌在內，目前許多革蘭氏陰性菌均能在溶菌基因 E的作用下產生菌蛻[15-17]。如：多殺性巴氏桿菌菌蛻，霍亂弧菌菌蛻，沙門氏菌菌蛻等，用多殺性巴氏桿菌菌蛻免疫家兔，可以抵抗同源細菌的感染[18-19]；用霍亂弧菌菌蛻腹腔注射免疫小鼠，可產生霍亂弧菌特異性IgG反應和高效價抗體[20-21]；用沙門氏菌菌蛻和傳統的滅活菌免疫家禽，攻毒后發現菌蛻組表現出完全的免疫力，而滅活組仍攜帶有致病菌[22-23]。正是由于菌蛻具有如此多的優點，使得菌蛻日益成為當前疫苗研究的熱點。

目前，通常運用 λpL/pR-cI857轉錄調控系統，來實現Phix174的溶菌基因E可控表達的。但在菌蛻制備過程中存在兩點不足，一是溶菌前細菌需要在30 ℃以下進行培養，不利于細菌的大量生產。二是溫度由30 ℃突然轉為42 ℃時，熱沖擊容易對抗原決定簇結構造成影響。因此，開展對pL/pR-cI857轉錄調控系統的優化，實現λpL/pR-cI857系統在37 ℃時仍能穩定抑制基因E的表達，解決菌蛻制備過程中存在的不足，為進一步開展菌蛻疫苗的研制提供技術支持，具有重要的經濟意義[24]。

本實驗通過定點突變技術，使λpR啟動子的第2個操縱基因 (OR2) 的第9位堿基由T突變為C (T→C)，突變后的λpR系統在37 ℃的高溫下仍能穩定抑制基因 E的表達，而當溫度達到39 ℃～42 ℃時開始誘導細胞溶菌。溶菌試驗結果表明，轉化溶菌質粒pUC19-cI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，在37 ℃培養至OD600值為0.4，轉入42 ℃誘導4 h后，溶菌率為61.53%，明顯低于其他實驗組的溶菌效率。這主要是因為轉化溶菌質粒的大腸桿菌DH5α在37 ℃培養時，由于溫度已經高于30 ℃，阻遏蛋白cI857失活，E基因已經開始表達，導致大部分細菌在37 ℃已經溶菌死亡。而轉化pUC19-ΔcI857-E-rrnB的大腸桿菌DH5α，則可以在37℃的條件下穩定生長，42 ℃誘導后，可以引起細菌的溶菌，生成菌蛻。上述結果表明，通過對λpR啟動子的突變，成功實現了λpL/pR-cI857系統在37 ℃時溶菌基因E的抑制作用。

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichia coli，APEC) 引起的嚴重危害家禽養殖業的傳染病之一[25]。目前，國內對禽大腸桿菌病的防治除加強管理外，主要采用藥物防治，國內尚缺乏自主研制的商品化疫苗。本研究中，APEC的 DE17分離株轉化pUC19-ΔcI857-E-rrnB后，在37 ℃的培養條件下，E基因的表達被成功抑制，42 ℃誘導后，生成APEC的菌蛻，為進一步研究APEC的菌蛻疫苗用于該病的防治提供思路。

本研究通過對λpL/pR-cI857系統的優化，使得λpL/pR-cI857系統在37 ℃時仍能穩定抑制基因 E的表達，解決了菌蛻制備過程中存在的不足，為進一步研究菌蛻疫苗提供參考。

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August 4, 2012; Accepted: September 28, 2012

Shengqing Yu. Tel: +86-21-34293461; E-mail: yus@shvri.ac.cn Xian’gan Han. Tel: +86-21-34293412; E-mail: hanxgan@163.com

國家自然科學基金 (Nos. 31001078，31072161，30871851) 資助。

Mutation of λpL/pR-cI857 system for production of bacterial ghost inEscherichia coli

Hongliang Dong1,2, Xian’gan Han2, Hao Bai2, Liang He2, Lei Liu2, Rui Liu2, Tongjie Chai1,Chan Ding2, Haiwen Liu2, and Shengqing Yu2

1School of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Taian271100,Shandong,China
2Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai200241,China

Bacterial ghost is intact envelope of Gram-negative bacteria, which is produced by the function of the lysis gene E from bacteriophage PhiX174. The expression of the lysis gene E is usually controlled by the thermosensitive λpL/pR-cI857 promoter. In this study, we described a mutation (T→C) at the ninth nucleotide of the OR2 in the λpR promoter of the λpL/pR-cI857 system by overlap PCR. The bacteriolytic assay showed that the mutation in the λpL/pR-cI857 system enhanced the temperature of repressing the expression of gene E up to 37 ℃ . The lysis efficiency of altered λpR promoter inEscherichia coliDH5α and avian pathogenicE. coliDE17 was up to 99.9%. The expanded range of temperature will benefit for the production of bacterial ghost.

Escherichia coli, bacterial ghosts, overlap PCR, mutation

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31001078, 31072161, 30871851).