復合誘變選育高效生物破乳劑產生菌及其特性

劉 暢，楊基先，李 昂，李 旭，馬 放，陸 建

(1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.中國宜興環保科技工業園科技發展局，214200江蘇宜興)

生物破乳劑的高效性和環保性是化學破乳劑無法比擬的.在原油脫水、油污分離、含油廢水處理等領域開發、應用前景十分廣闊［1-6］.目前，生物破乳劑仍處于實驗室研發階段，無法進行大規模應用，其中野生型生物破乳劑產生菌的破乳能力和破乳活性物質產量較低成為主要限制因素之一.因此，采用人工誘變或生物改造方法對野生型的生物破乳劑產生菌進行改造，提高生物破乳劑的產率及活性，對生物破乳劑的工程化應用具有重要意義.

以人工誘變基因突變為基礎的誘變育種方法，如利用物理(紫外輻射、微波)和化學(亞硝基胍、亞硝酸等)誘變獲得突變體，已成為發酵工業中獲得優良高產菌株的主要途徑，也是研究微生物生理代謝機制的主流方法［7-8］.傳統的誘變育種多采用單一的誘變方法，盲目性和隨機性較大，且隨著誘變次數的增多，菌種的耐受性增強，誘變效率下降.因此，使用多種誘變方法，通過協同作用進行復合誘變成為誘變育種的一個重要趨勢.為提高生物破乳菌的破乳能力，對生物破乳劑產生菌Bacillus mojavensis XH1進行復合誘變育種研究，篩選高效的破乳劑產生菌突變株，為工業生產提供優質的菌種資源.

1 實驗

1.1 實驗材料

1.1.1 出發菌株

生物破乳劑產生菌株XH1分離自大慶油田受石油污染的土壤，經生理生化及16S rDNA鑒定為芽孢桿菌屬莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)，由本實驗室保藏．

1.1.2 培養基及模型乳狀液的配制

篩選培養基:NH4Cl 4.0 g，K2HPO44.0 g，KH2PO46.0 g，MgSO4·H2O 0.2 g，微量元素溶液1 mL，液體石蠟4%(體積分數)，去離子水1 L，于121℃下滅菌20 min.

發酵培養基:NH4Cl4.0 g，K2HPO44.0 g，KH2PO46.0 g，MgSO4·H2O 0.2 g，微量元素溶液1 mL，液體石蠟4%(體積分數)，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，去離子水1 L，于112℃下滅菌20 min，葡萄糖單獨滅菌.培養條件:XH1菌株種子液置于30℃、140 r/min的搖床中培養.

平板培養基:牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉20.0 g，葡萄糖5.0 g，去離子水1 L，pH=7.0，于112℃下滅菌20 min.

模型乳狀液的配制方法見文獻［9］.

1.1.3 實驗儀器和設備

紫外-可見分光光度計:北京普析通用儀器有限公司T6新世紀;低溫高速離心機:SIGMA 2-16PX型;乳化剪切機:FLUKO awdel F6/10.

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變方法

1)紫外誘變.對數期的XH1菌株離心10 min(5 kr/min)收集菌體制成菌懸液，用生理鹽水洗滌懸浮后的菌懸液放于直距30 cm、20 W紫外燈下照射一定時間后，在紅燈下稀釋適當倍數，取0.1 mL涂平板30℃光培養，計平板菌落數，計算致死率，繪制致死曲線并挑出菌落形態差異明顯的突變菌落繼代培養.

2)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG)誘變.對數期的XH1菌株離心10 min(5 kr/min)收集菌體制成菌懸液，用pH 7.0的0.05 mol/L的磷酸緩沖液配制一定質量濃度的NTG溶液，取1 mL菌懸液加入9 mL pH 7.0的0.05 mol/L的磷酸緩沖液充分混合，于37℃下震蕩培養30 min后，取2 mL加入10 mL 0.07 mol/L Na2HPO4液中止，稀釋后取0.1 mL涂平板，30℃，計平板菌落數，計算致死率，繪制致死曲線.

1.2.2 致死率的計算及菌株初篩

致死率/%=［(對照1 mL菌液中的活菌數-處理后1 mL菌液中的活菌數)/對照1 mL菌液中的活菌液］×100.

紫外誘變以80%左右的致死率確定誘變時間，NTG誘變以70%～80%左右的致死率確定誘變時間后，在平板上隨機挑取直徑較大的單菌落進行初篩.

1.2.3 復篩及破乳劑產生菌破乳性能的測定

復篩時選取初篩中發生正突變的菌株，采用液態發酵，測定每株菌株發酵液的破乳能力，并測試其連續傳代后的破乳能力，考察突變體的遺傳穩定性.原始菌株和突變體的破乳率和生物量的測定方法見文獻［9］.

2 結果與分析

2.1 紫外線輻射后突變株的選擇

通過不同紫外線輻照時間對出發菌株XH1的致死率和正突變率的雙重影響來確定最佳紫外輻射強度，通過比較突變株與出發菌株破乳率的高低來計算正變率，結果見圖1.隨紫外線照射時間的增加，細菌死亡率也逐漸增加，當紫外輻照時間達2 min時，出發菌株XH1的死亡率為83.13%，這時細菌的正突變率相對最大為27.57%，因此，確定紫外線最佳輻射時間為2 min.紫外線誘變篩選突變菌株的過程見文獻［10］，隨機挑取直徑較大的單菌落放入發酵培養基中培養24 h，測試其破乳能力，初選出8株正突變菌株(表1所示)，經過連續傳代后測其破乳能力，考察突變體的遺傳穩定性.大多數突變菌株顯示出不穩定的破乳性能遺傳特性，破乳能力都有所下降.綜合對比后篩選出4株破乳能力相對穩定的突變株，分別命名為XV2、XV7、XV15和XV26.其中，XV2的12 h和24 h的破乳率分別比原始菌株XH1高出42.4%和12.4%，因此選擇其為下一輪誘變的出發菌株.

圖1 紫外輻照時間對XH1致死率和正突變率的影響

表1 紫外誘變篩選突變菌株破乳能力的傳代穩定性

2.2 紫外線與NTG復合誘變高效生物破乳劑產生菌突變株的選擇

2.2.1 NTG最佳處理劑量的選擇

超誘變劑亞硝基胍(NTG)能使細胞發生一次或多次突變，在復制叉附近1個基因突變能誘發附近位置的基因陸續連鎖突變［11-12］.以經過紫外輻射篩選出的XV2為初發菌株，經NTG質量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/L處理20 min后，其致死率和正突變率結果見圖2.隨著NTG質量濃度的增加，菌體死亡率也隨之增加.當NTG質量濃度為40 mg/L時，菌株XV2的死亡率達73.64%，正突變率為21.47%，菌體的死亡率較高而且可以保障較高的正突變率，因此，確定NTG的最佳處理質量濃度為40 mg/L.

2.2.2 紫外線與NTG復合處理突變株的選擇

將經NTG處理后的菌株XV2的菌懸液接種到篩選培養基中，置于搖床轉數為140 r/min的培養條件下，30℃培養3～5 d后，將菌液梯度稀釋后，均勻涂布于平板培養基中，隨機挑取直徑較大的單菌落放入發酵培養基中培養24 h，測試破乳能力.在大量的突變體中篩選出3株破乳能力明顯高于XV2的突變菌株，分別命名為XN5、XN17和XN23.經過連續的傳代進行遺傳穩定性考察，結果顯示XN5的破乳能力比較穩定，見表2.XN5的12 h和24 h破乳率分別為94.17%和98.67%，比其出發菌株XV2分別提高了15.73%和2.42%，比原始菌株XH1提高了64.81%和15.12%.

圖2 NTG質量濃度對XV2致死率和正突變率的影響

表2 紫外與NTG復合誘變篩選突變菌株破乳能力的傳代穩定性

2.3 復合誘變后的菌株XN5與原始菌株XH1破乳性能的對比

在碳源為葡萄糖10 g/L和液體石蠟的混合碳源，其中液體石蠟投加量為4%(質量分數)，氮源為NH4Cl 4.0 g/L與酵母膏的混合氮源，其中酵母膏投加量為1.0 g/L，溫度30℃，初始pH=6.5，搖床轉數為140 r/min的培養條件下，探討了突變體XN5和原始菌株XH1生長曲線的對比和不同培養時間破乳率的變化(圖3、4所示).通過對比發現突變株和原始菌株的生長曲線沒有明顯區別，都在14～26 h時處于對數生長期，26 h以后進入了穩定期和衰亡期，但是單位體積發酵液中的生物量，突變菌株與原始菌株相比有所提高.培養時間在14～24 h時，突變株和原始菌株都具有較高的破乳活性，而且突變菌株的破乳能力明顯優于原始菌株，突變菌株的破乳速率也明顯高于原始菌株，當培養時間為20 h時，突變菌株12 h的破乳率比原始菌株提高了64.81%.

圖3 突變體XN5和原始菌株XH1的生長曲線對比

圖4 突變體XN5和原始菌株XH1不同培養時間破乳率對比

3 結論

1)紫外和亞硝基胍具有很好的協同作用，利用二者復合處理誘變對象，使誘變產生的突變體后代遺傳基礎比較復雜，在世代分離選擇中通過優良基因的重組和累加，可獲得較高的正突變率，是生物破乳劑產生菌誘變育種的一種好方法.

2)生物破乳劑產生菌Bacillus mojavensis XH1在采用紫外和亞硝基胍(NTG)復合誘變后篩選出了一株遺傳特性穩定、破乳性能更高的突變體XN5.突變株XN5的12 h和24 h破乳率分別為94.17%和98.67%，比原始菌株XH1提高了64.81%和15.12%.

3)在最佳培養條件下，突變菌株XN5和出發菌株XH1的生長曲線基本一致;在不同的培養時間下，突變菌株的12 h和24 h破乳率比原始菌株XH1分別提高了35.91%～38.53%和10.6%～13.95%.

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