長期膽汁反流對大鼠胃黏膜的影響

王學偉 曹勤 唐劍敏

（上海中醫藥大學附屬普陀醫院消化內科，＊病理科，上海 200062）

長期膽汁反流對胃和食管黏膜的影響尚不明確。研究［1］發現膽汁反流至胃，甚至食管，十分常見。Dixon等［2］通過病理研究發現，膽汁反流可能與胃竇黏膜腸化生有關。近年來研究［3］發現，膽汁反流不但與反流性食管炎有關，而且可能是Barrett食管的重要病因，還可能與食管腺癌的發生有關［4］。因此，明確長期膽汁反流對胃和食管黏膜的病理影響，具有重要的臨床意義。本研究建立模擬人體生理性膽汁反流途徑的大鼠模型，觀察長期膽汁反流對大鼠胃黏膜的病理影響，通過免疫組化方法研究長期膽汁反流對胃泌素表達的影響，并探討其在膽汁反流中的作用。

1 資料與方法

1.1 動物和抗體 Sprague－Dawley大鼠，清潔級，雄性，8周齡，體質量250～300 g，購自中國科學院上海實驗動物中心。羊抗大鼠胃泌素多克隆IgG抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗羊IgG抗體購自北京中山公司。

1.2 動物模型 大鼠預適應1周，術前禁食24 h，只給予5%葡萄糖液，術前6 h禁葡萄糖液。麻醉采用10%水合氯醛0.3 mL／100 g腹腔注射。上腹正中切口4 cm，于十二指腸膽總管開口下0.5 cm處橫斷十二指腸、縫合斷端，于前胃與腺胃交界2 mm處前胃大彎側作1 cm切口，距Treitz韌帶4 cm遠側空腸系膜對側作1 cm切口，行胃－空腸吻口。術后24 h禁食，給予5%葡萄糖液，24 h后少量進食飼料，3 d后恢復正常飲食。

1.3 組織病理 模型建立1年后，13只大鼠經10%水合氯醛0.3 mL／100 g腹腔注射麻醉，斷頭法處死，大鼠胃經10%甲醛固定72 h，石蠟包埋，切片厚度4μm，HE染色。

1.4 免疫組化 切片65℃烘烤1 h，脫蠟、水化，自來水洗10 min，蒸餾水洗2次，蒸餾水浸泡5 min；再將切片放入3%H2O2，室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶活性，自來水洗10 min，蒸餾水洗2次，蒸餾水浸泡5 min；于檸檬酸緩沖液中微波抗原修復15 min，磷酸緩沖液（PBS）洗，5 min×3次；將切片放入正常血清中，室溫孵育30 min，以封閉內源性抗原結合位點；加入經PBS 1：100稀釋的一抗，4℃孵育過夜；PBS洗，5 min×3次；加入二抗，室溫孵育1 h，PBS洗5 min×3次；加入酶標物，室溫孵育1 h，PBS洗5 min×3次；加入DAB顯色液，顯色6 s，自來水洗10 min，蘇木素復染20 s，自來水洗5 min，鹽酸浸泡1 s，自來水洗5 min，室溫晾干，中性樹膠封片。

2 結 果

2.1 組織病理 正常1年齡大鼠中，僅少數胃部有輕度慢性炎性反應。膽汁反流1年后，13只大鼠腺胃部腺體增生非常顯著，大多數同時伴有腺體顯著擴張；長期膽汁反流導致3只大鼠腺體發生異型增生，其中1只出現癌變；膽汁反流大鼠中糜爛和潰瘍少見，僅見于3只和1只大鼠。與此類似，腸化生極少見，僅見于1只大鼠（圖1）。膽汁反流1年后，13只大鼠前胃部鱗狀上皮顯著增生，并伴有明顯角化，其中7只大鼠在黏膜下層形成巨大的角化珠，更有3只大鼠形成角化囊腫；與腺胃部類似，前胃部腸化生極少見，僅見于1只大鼠；所有膽汁反流大鼠前胃均未見到糜爛或潰瘍（圖2）。

2.2 免疫組化 正常大鼠胃泌素陽性染色細胞主要分布于腺胃胃竇部上皮內，并且數量較少。膽汁反流1年后，腺胃胃竇部上皮內胃泌素陽性染色細胞顯著增生，呈聚集性存在，腺胃胃體部上皮內亦可見胃泌素陽性染色細胞增生（圖3）。

圖1－1 腺胃腺體增生、擴張

圖1－2 腺胃腺體異型增生

圖1－3 腺胃腺體癌變

圖1－4 腺胃黏膜糜爛

圖1－5 腺胃潰瘍

圖1－6 腺胃腺體腸化生

圖2－1 前胃鱗狀上皮

圖2－2 前胃鱗狀上皮角化珠

圖2－3 前胃角化囊腫增生、角化

圖2－4 前胃鱗狀上皮腸化生

圖3－1 正常大鼠胃竇胃泌素陽性染色細胞呈單個存在

圖3－2 正常大鼠胃體亦有少量胃泌素陽性染色細胞

圖3－3 長期膽汁反流大鼠胃竇胃泌素陽性染色細胞增生伴腺體增生

圖3－4 膽汁反流大鼠胃體胃泌素陽性染色細胞增生伴腺體增生、擴張

3 討 論

大鼠的胃由近端的前胃和遠端的腺胃組成，前胃黏膜被覆鱗狀上皮，與食管相似，腺胃類似于人胃，分為胃體和胃竇。本模型根據Kaminishi等［5］建立的模型而改進，使膽汁通過幽門反流入腺胃，經位于前胃的胃－空腸吻合口流入空腸，整個腺胃保持完整，故類似于人體生理性膽汁反流途徑，不僅便于觀察膽汁反流對腺胃黏膜的影響，還可觀察其對前胃鱗狀上皮的影響。

本研究發現，長期膽汁反流導致大鼠腺胃胃體和胃竇小凹上皮增生，與1994年休斯頓會議對反應性胃炎（reactive gastritis，RG）的描述一致［6］。所有大鼠腺胃腺體增生，并呈囊狀擴張，與Taylor等［7］和 Mukaisho等［8］的發現一致，提示胃腺體增生、擴張是膽汁反流性胃炎的特征。本模型僅發現1例腺胃癌變，這可能是由于本模型中腺胃是完整的，類似于生理性膽汁反流；而其他模型均將腺胃與空腸吻合，類似于Billroth II手術，膽汁反流強度可能高于生理性反流，因此胃癌發生率高。臨床中發現，兩種不同類型上皮的交界處易發生腫瘤。在其他模型中，胃癌多發生于腺胃－空腸吻合口周圍。有研究者認為，腸化生是胃黏膜的一種適應性改變，當胃黏膜的局部微環境變為類似于腸內環境時，胃黏膜便出現腸化生，以此來減堿性腸液對黏膜的損傷。將帶血管蒂的大鼠胃壁瓣分別移植到腸壁上，移植黏膜發生典型的腸化生，pH測定發現移植黏膜的pH＞6，顯著高于胃內（一般pH＜4.5）。在腺胃－空腸吻合口周圍，膽汁反流強度可能要高于本模型，造成局部黏膜微環境的pH顯著升高，因此腸化生發生率較高。本模型中鱗狀上皮顯著增生，呈乳頭狀凸起，上皮增生形成角化珠和角化囊腫。本模型盡管膽汁反流長達1年，卻僅有1例腸化生，更無腺癌發生。此差異可能與手術方式不同有關。

膽汁反流可導致高胃泌素血癥，并通過抑制生長抑素的釋放、降低血清生長抑素的水平進一步加重高胃泌素血癥；高胃泌素血癥又會加重膽汁反流。患者行膽囊切除后6個月，其胃竇黏膜G細胞的數量即有增加，并存在顯著的膽汁反流性胃炎和小凹上皮增生，這提示膽汁反流可導致G細胞增生，并引起高胃泌素血癥。通過免疫組化方法，我們發現本模型中腺胃胃竇和胃體G細胞顯著增生。膽囊收縮素－2（cholecystokinin，CCK－2）受體是胃泌素的特異性受體，主要表達于壁細胞和ECL細胞。我們推測膽汁反流導致G細胞增生，引起高胃泌素血癥，在循環胃泌素的作用下，壁細胞上的CCK－2受體被激活并分泌HB－EGF和雙調蛋白等生長因子，促進胃上皮增殖，進一步導致異型增生和癌變。

綜上所述，我們通過建立模擬人體生理性膽汁反流的大鼠模型發現，長期膽汁反流能導致腺胃腺體增生并發生異型增生和癌變，前胃鱗狀上皮亦顯著增生，這可能與長期膽汁反流所致的腺胃G細胞增生和高胃泌素血癥有關。

［1］ Fein M，Freys SM，Sailer M，et al.Gastric bilirubin monitoring to assess duodenogastric reflux［J］.Dig Dis Sci，2002，47（12）：2769－2774.

［2］ Dixon MF，Mapstone NP，Neville PM，et al.Bile reflux gastritis and intestinal metaplasia at the cardia［J］.Gut，2002，51（3）：351－355.

［3］ Oberg S，Peters JH，DeMeester TR，et al.Determinants of intestinal metaplasia within the columnar－lined esophagus［J］.Arch Surg，2000，135（6）：651－655.

［4］ O′riordan JM，Tucker ON，Byrne PJ，et al.Factors influencing the development of Barrett＇s epithelium in the esophageal remnant postesophagectomy［J］.Am J Gastroenterol，2004，99（2）：205－211.

［5］ Kaminishi M，Sadatsuki H，Johjima Y，et al.A new model for production of chronic gastric ulcer by duodenogastric reflux in rats［J］.Gastroenterology，1987，92（6）：1913－1918.

［6］ Dixon MF，Genta RM，Yardley JH，et al.Classification and grading of gastritis.The updated Sydney system［J］.The A－merican Journal of Surgical Pathology，1996，20（10）：1161－1181.

［7］ Taylor PR，Mason RC，Filipe MI，et al.Gastric carcinogenesis in the rat induced by duodenogastric reflux without carcinogens：morphology，mucin histochemistry，polyamine metabolism，and labelling index［J］.Gut，1991，32（12）：1447－1454.

［8］ Mukaisho K，Miwa K，Kumagai H，et al.Gastric carcinogenesis by duodenal reflux through gut regenerative cell lineage［J］.Dig Dis Sci，2003，48（11）：2153－2158.