冠狀動脈微栓塞后Toll樣受體4的變化

常書福 馬劍英 錢菊英 陳章煒 姚瑞明 葛均波

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海市心血管病研究所，上海 200032）

冠狀動脈斑塊破裂或血栓脫落等引起的冠狀動脈微栓塞（coronary microembolization，CME）可導(dǎo)致心肌缺血、壞死，引起重度心律失常、心室收縮功能障礙［1］。本研究采用冠狀動脈介入方法建立的豬CME模型，探討CME后Toll樣受體4（Toll－like receptor 4，TLR4）的變化情況。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 12周齡的健康小型家豬12頭，體質(zhì)量21～25 kg，實驗組和對照組各6頭。

1.2 微栓塞球制備 取直徑42μm的微栓塞球10～15μL（Dyno公司，挪威），放入1.5 mL離心管中，管中再加入1 mL弱0.9%氯化鈉液，顯微鏡下計數(shù)；然后取15萬個微球放入60 mL離心管中，加入0.9%氯化鈉液配成40～45 mL懸液。每次使用前劇烈震蕩5s，將懸液抽入60 mL注射器內(nèi)，然后用5 mL0.9%氯化鈉液沖洗2次。

1.3 動物模型建立 肌內(nèi)注射氯胺酮（5 mg／kg），以地西泮（10 mg／kg）和阿托品（0.08 mg／kg）誘導(dǎo)麻醉后，用3%戊巴比妥維持麻醉。建立耳靜脈通道，滴注0.9%氯化鈉液。分離右側(cè)股動脈，置入7F動脈鞘，經(jīng)鞘管首劑給予肝素200 U／kg，此后每1 h靜脈注射肝素100 U／kg，維持肝素化。

用數(shù)字減影血管造影儀行冠狀動脈造影，送入7F EBU3.5指引導(dǎo)管至左冠狀動脈口，確定前降支位置及分布。送入微導(dǎo)管（3.0／2.8F）至前降支中段，經(jīng)微導(dǎo)管將微栓塞球懸液注入前降支內(nèi)，再用10 mL0.9%氯化鈉液沖洗微導(dǎo)管并注入冠狀動脈內(nèi)，制成CME動脈模型（研究組）。對照組則在其前降支注入等量的0.9%氯化鈉液。然后兩組再次行冠狀動脈造影。

1.4 樣本采集和分析

1.4.1 樣本采集 1周后靜脈注射30%氯化鉀30 mL，處死CME模型豬，取出心臟，平行于房室溝切塊，前壁、后壁各取5塊質(zhì)量為50～100 mg的心肌組織，液氮冷凍后移入－70℃冰箱，用于RNA及蛋白分析。

1.4.2 蛋白質(zhì)印跡（Western－blot） 取50～100 mg心肌組織，提取蛋白并用二可辛酸（bicinchonininc acid，BCA）法定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳等。TLR4抗體購自Santa Cruz公司。

1.4.3 實時聚合酶鏈反應(yīng)（real－time polymerase chain reaction） 取50～100 mg心肌組織，提取其RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；外源性TLR4、內(nèi)參GAPDH均由上海生工公司合成，TLR4引物序列正義鏈及反義鏈分別為5′－CTCTGCCTTCACTACAGAGA－3′和5′－CTGAGTCGTCTCCAGAAGAT－3′，GAPDH引物序列正義鏈、反義鏈分別為5′－TCATCAGCAATGCCTCCTGTACCA－3′和 5′－TATTTGGCAGGTTTCTCCAGACGG－3′。 擴(kuò) 增 方 案：94℃加熱5 min；然后94℃加熱30 s、55℃加熱30 s、72℃加熱30 s，循環(huán)進(jìn)行40次；72℃延伸10 min。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。2組之間比較采用兩獨立樣本的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織TLR4蛋白水平 豬心肌組織TLR4蛋白水平見圖1。CME1周后實驗組心肌組織前壁TLR4蛋白水平顯著高于后壁（P＜0.05）。而對照組前壁、后壁TLR4蛋白水平和CME組后壁相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

圖1 豬心肌組織中TLR4蛋白水平

2.2 心肌組織TLR4 mRNA水平 豬心肌組織TLR4 mRNA水平見表1。CME1周后實驗組心肌組織前壁TLR4 mRNA水平顯著高于后壁（P＜0.05）；而對照組前壁、后壁TLR4 mRNA水平與CME組后壁相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 豬心肌組織中TLR4蛋白水平

3 討 論

CME后會引發(fā)局灶性心肌微梗死和一過性心肌收縮功能障礙，但1周左右可恢復(fù)［2－3］。由于冠狀動脈微血管網(wǎng)豐富，多處心肌壞死可引起局部心肌收縮功能障礙，但這并不是導(dǎo)致心肌收縮功能減弱的主要原因［2］。目前認(rèn)為，炎性反應(yīng)是CME后心功能變化的主要發(fā)生機(jī)制［4］。

TLRs家族在病原體的識別和激活天然免疫方面發(fā)揮著非常重要的作用。激活的TLRs不僅可以誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，而且有利于特異性免疫反應(yīng)發(fā)生。TLR4在體內(nèi)分布廣泛，分布于心肌中的TLR4與心血管疾病關(guān)系密切［5］。心力衰竭的病理機(jī)制復(fù)雜，炎性反應(yīng)也參與了這一過程。在心力衰竭的動物模型和患者中，TLRs被激活，且其分布形態(tài)發(fā)生了變化。在正常大鼠和人心肌中，TLR4彌散分布，主要分布在心肌內(nèi)；而在心力衰竭患者中，TLR4呈局灶性聚集分布［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，心肌TLR4表達(dá)在CME1周后顯著升高，而后壁與對照組前后壁無顯著差異，提示TLR4可能參與了CME后的炎性反應(yīng)。

［1］ Stenberg TA，Steigen T，Myrmel T.Microvascular occlusions and coronary microembolization［J］.Scand Cardiovasc J，2011，45（5）：258－260.

［2］ Dorge H，Schulz R，Belosjorow S，et al.Coronary microembolization：the role of TNF－αin contractile dysfunction［J］.J Mol Cell Cardiol，2002，34（1）：51－62.

［3］ Ma J，Qian J，Ge J，et al.Changes in left ventricular ejection fraction and coronary flow reserve after coronary microembolization［J］.Arch Med Sci，2012，8（1）：63－69.

［4］ Heusch G，Kleinbongard P，Bose D，et al.Coronary microembolization from bedside to bench and back to bedside［J］.Circulation，2009，120（18）：1822－1836.

［5］ Lee CC，Avalos AM，Ploegh HL.Accessory molecules for Toll－like receptors and their function［J］.Nat Rev Immunol，2012，12（3）：168－179.

［6］ Frantz S，Kobzik L，Kim YD，et al.Toll4（TLR4）expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium［J］.J Clin Invest，1999，104（3）：271－280.