P17菌株產生磷酸酶的影響因素及其定域研究

鐘傳青，黃為一

(1.山東建筑大學市政與環境工程學院，山東 濟南 250101;2.南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京 210095)

0 引言

凡促使磷酸中的酯和酐水解的一大類酶，統稱為磷酸酶，磷酸酶是土壤中最活躍的酶類，其酶促反應能夠加速有機磷的脫磷速度[1]。磷酸酶是表征土壤生物學活性的重要酶之一[2]，其活性可作為衡量土壤肥力的指標;產生酸性磷酸酶的生物有微生物、原生動物和植物等;產生堿性磷酸酶的生物有微生物、藻類、蚯蚓等[3]。編碼磷酸酶的基因已經被克隆出來[4]，張國慶等分離純化了一株內生真菌中的酸性磷酸酶[5]。

磷是促進植物生長的重要元素之一[6]，無論是酸性磷酸酶還是堿性磷酸酶，均與土壤有效磷有很強相關性[7]。P17菌株為作者從南京市化工磷肥廠區磷礦粉與土的混合物中分離出的一株解磷微生物，經鑒定屬于巨大芽孢桿菌屬，該菌株能夠分泌高活性的磷酸酶[8]，將土壤中難溶性有機磷轉化為有效磷，從而可以直接被植物生長利用。作為一種酶類，磷酸酶的活性受多種因素影響，為保證解磷微生物P17菌株施入土壤后發揮高的解磷活性，本課題組研究了P17菌株發酵過程中影響磷酸酶活性的因素，并確定該酶的定域，為巨大芽孢桿菌磷酸酶制劑的制備及下游生產提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器:搖床，顯微鏡，分光光度計，離心機等。

菌株:P17菌株。

培養基:NBRIP培養基。其成分為:Ca3(PO4)25.0g，(NH4)2SO40.1g，MgSO4·7H2O 0.25g，KCl 0.2 g，葡萄糖10.0g，MgCl2·7H2O 5.0g，蒸餾水 1000mL，pH6.8 ～7.0。

1.2 試劑

磷酸酶活性測定:改進的MUB緩沖液;0.025M對硝基苯磷酸二鈉溶液;0.5M氯化鈣;0.5M氫氧化鈉;標準對硝基酚溶液。

磷酸酶定域研究:10mmol/L Tris·Cl(pH8.0);10mmol/L Tris·Cl(pH7.5);25%蔗糖。

發酵液蛋白含量測定所需試劑:0.15mol/L NaCl溶液;標準溶液;考馬斯亮藍試劑。

1.3 方法

(1)不同碳、氮源對P17菌株產生磷酸酶活性的影響

分別用等量碳源，如蔗糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、糊精、木糖、山梨糖、淀粉等替代NBRIP培養基內的葡萄糖;或者用等量氮源如氯化銨、磷酸氫二銨、硝酸銨、硝酸鈉、黃豆粉、胰蛋白胨、蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母膏等替代NBRIP培養基中的硫酸銨，其它成分和含量保持不變。

表中：ρ為土體密度，ω為天然含水率，ωp為土體塑限，ωL為土體液限，c為粘聚力，φ為內摩擦角，k為土體的滲透系數。

配制含不同碳源、氮源的培養基，每種碳源、氮源各設三個重復，分裝50mL于250mL三角瓶中，滅菌。按5%接種量接種在含不同碳源、氮源培養基內，48h后檢測發酵液pH值、吸光值(550nm)、上清酸性和堿性磷酸酶活性。

(2)磷酸鹽種類與P17菌株生長以及磷酸酶活性的關系

分別用等量磷酸鹽替代NBRIP培養基中的磷酸鈣，接種后檢測磷酸鹽種類對P17菌株的生長、發酵液pH值以及酸性、堿性磷酸酶活性的影響。

(3)磷酸酶活性測定

按照佩奇等提供方法檢測發酵液中磷酸酶活性[9]。

(4)發酵液pH值測定

(5)發酵液生物量測定

打開分光光度計，將波長調在550nm，預熱半小時后測量發酵液的吸光值。

(6)磷酸酶定域研究

取發酵24h菌液，按照戴樹桂等方法測定酶域所在[10]。

2 結果與分析

2.1 不同碳源與P17菌株生長及其磷酸酶活性的關系

由表1可知，P17菌株在以葡萄糖為碳源時酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性最高，菌體生長量最大，利于代謝產物的產生;而以麥芽糖、糊精和可溶性淀粉等復合碳源為碳源時P17菌株產生的磷酸酶活性較低;以甘露醇和可溶性淀粉為碳源時產生的堿性磷酸酶活性較低。

表1 碳源種類對P17菌株生長以及產生磷酸酶活性的影響

2.2 不同氮源與P17菌株生長磷酸酶活性的關系

表2 氮源種類對P17菌株生長以及產生磷酸酶活性的影響

表2中數據表明，巨大芽胞桿菌P17菌株在以黃豆粉、胰蛋白胨復合氮源等為氮源時能夠產生較高活性的酸性磷酸酶;以胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏等為氮源時也能產生很高活性的堿性磷酸酶。可能是復合氮源內含有能夠提高磷酸酶活性的微量元素或者金屬離子。

2.3 磷酸鹽種類與P17菌株生長以及磷酸酶活性的關系

由圖1可以看出，發酵過程中，以各種磷酸鹽為磷源時巨大芽孢桿菌P17菌株產生的酸性磷酸酶活性除以黃麥嶺磷礦粉為磷源外普遍高于堿性磷酸酶活性。以植酸鈣為磷源時酸性磷酸酶活性最高，說明有機磷源較少時會誘導酸性磷酸酶的產生;而培養基中沒有有機磷源、只有難溶無機磷源時酸性磷酸酶仍有活性，說明培養基中存在其它底物如微生物菌體細胞膜的磷脂、核酸等，也可能與菌體生長量有關，以植酸鈣為磷源時巨大芽孢桿菌P17菌株長勢最好，從而促進了酸性磷酸酶的分泌。而堿性磷酸酶在培養基中沒有磷源時活性最高，其次為黃麥嶺磷礦粉，以NH4H2PO4為磷源時該方法不能檢測堿性磷酸酶活性。

圖1 巨大芽孢桿菌P17菌株以不同含磷物質為磷源時磷酸酶活性比較

2.4 磷酸酶定域研究

表3 P17菌株產生磷酸酶定域的研究結果

由表3可以看出，巨大芽孢桿菌P17菌株發酵至16h甚至48h后，各成分酶活性大小順序為:磷酸酶胞外提取液S1+S2+S3＞膜內提取液S5＞膜周質提取液S4。說明酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均為胞外酶，在發酵過程中大部分被分泌到胞外。

3 研究結論

前期研究表明P17菌株能夠有效溶解植酸鈣、卵磷脂等[8]，并且能夠分泌大量的有機酸和無機酸[11]，將土壤、磷礦粉中的難溶性磷轉變為有效磷，以利于植物吸收。本研究結果表明P17菌株能夠產生高活性的磷酸酶，且不同的碳源、氮源及磷酸鹽對于該菌株磷酸酶的活性有著較大的影響，相同的碳源、氮源及磷酸鹽對該菌株酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的影響結果不同。該菌株以葡萄糖為碳源、黃豆粉等復合氮源、植酸鈣為磷源時酸性磷酸酶活性最高，且該菌株分泌的酸性和堿性磷酸酶均為胞外酶。磷酸酶可以直接將難溶的有機磷轉化為植物可以直接吸收利用的無機磷，該菌株能夠分泌磷酸酶解釋了巨大芽孢桿菌的作用機制。從研究結果來看，因磷酸酶為胞外酶，表明其發酵液可以直接用于農業生產;同時該研究也為深入探討解磷微生物促進植物生長的作用機制、生物磷肥和磷酸酶制劑的研究與開發奠定了理論基礎。

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