RP-HPLC 法同時測定枇杷莖枝、葉中齊墩果酸和熊果酸的含量

陳白靈 蘇本偉

1.廣西玉林市骨科醫院，廣西 玉林 537000;2.廣西欽州市中醫院，廣西 欽州 535000

枇杷系薔薇科枇杷屬植物枇杷 (Eriobotrya Japonica(Thunb.)Lindl.)，廣泛分布于廣東、廣西、江蘇、福建、江西等地，具有較高的藥用價值［1］。近期對枇杷的研究主要集中于枇杷葉，研究表明其主要成分為三萜酸和倍半萜及其苷類，藥理活性的報道主要集中在三萜酸的抗炎、降血糖和抗病毒活性方面，齊墩果酸、熊果酸含量明顯占優勢［2］。近年越來越多的文獻報道采用高效液相色譜法測定枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸的含量［3，4］，但對枇杷莖枝中熊果酸和齊墩果酸的含量測定尚未見報道。本實驗采用反相高效液相色譜法同時測定枇杷樹莖枝、葉中熊果酸和齊墩果酸的含量，具有準確、靈敏、快捷的特點，為對其進一步開發利用提供理論依據。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀;色譜柱Agilent-C18(5μm，4.6×250mm);GH-252型電子分析天平 (AND)，BP121S型電子分析天平 (德國Sartorius公司);LG16-W高速微量離心機 (北京醫用離心機廠);KQ-300DB型數控超聲波清洗器 (昆山)。齊墩果酸對照品 (中國藥品生物品檢定所，批號：110709-200505);熊果酸對照品 (中國藥品生物品檢定所，批號：110742-200516);乙腈、甲醇 (CNW、色譜純)，水為超純水，其他試劑均為分析純。樣品分別采自廣西巴馬、都安、欽州、玉林，采集時間為2011年5～7月，將采集的樣品洗凈陰干，枝、葉分開粉碎過45目備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 島津LC-20AT高效液相色譜儀;色譜柱Agilent-C18(5μm，4.6×250mm);流動相：甲醇-乙腈-0.05%醋酸銨溶液 (12：67：21);檢測波長為205nm;流速1.0ml/min，柱溫：室溫。齊墩果酸、熊果酸可以達到基線分離，峰形對稱，分離度好，對照品及樣品色譜圖見圖1。

2.2 對照品儲備液的制備 精密稱取齊墩果酸、熊果酸適量，加乙醇溶解并稀釋成每1ml中含0.209mg齊墩果酸、0.628mg熊果酸的混合對照品儲備液。

2.3 樣品溶液制備 精密稱取樣品粉末0.50g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇溶液25mL，超聲提取30分鐘，冷卻補重，搖勻，離心，經0.45μm微孔濾膜過濾，得樣品溶液。

2.4 線性關系考察 將齊墩果酸、熊果酸混合對照品溶液母液分別稀釋成質量濃度為 2.61，13.06，26.13，52.25，104.50，209mg · L-1;7.85，39.25，78.50，157，314，628 mg·L-1對照品溶液，分別進樣10μl，記錄，測定峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，將所得數據進行線性回歸。結果齊墩果酸回歸方程為 Y=4427.6X+4738.7，r=0.9998，線性范圍為 2.61 ～209mg·L-1，熊果酸回歸方程為 Y=4987.6X+13576，r=0.9999，線性范圍為7.85～628mg·L-1，結果表明在上述濃度范圍內，2成分濃度與峰面積呈良好線性關系。

2.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0，1，2，4，6，8，12h進樣10μl，測定峰面積，計算RSD，結果齊墩果酸RSD=0.99%，熊果酸RSD=0.76%，表明樣品在12h內保持穩定。

2.6 精密度試驗 取混合對照品重復進樣5次，每次進樣10μl，測定峰面積，計算 RSD，齊墩果酸 RSD=0.60%，熊果酸RSD=0.90%，結果表明儀器精密度符合要求。

2.7 重復性試驗 取同一批柿葉樣品，共5份，按“2.2”項制備樣品溶液，分別進樣10μL，測定峰面積，計算含量的RSD，齊墩果酸 RSD=0.80%，熊果酸 RSD=0.90%，，結果表明重復性良好。

2.8 回收率試驗 稱取已知含量的琵琶樣品6份，稱樣量約為制備量的一半，分別精密加入齊墩果酸、熊果酸適量，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，吸取10μl進行測定，計算。結果見表1。

表1 齊墩果酸、熊果酸加樣回收試驗結果

表2 不同產地枇杷莖枝、葉齊墩果酸、熊果酸含量

2.9 含量測定 分別取樣品溶液10μl進樣，測定峰面積，計算齊墩果酸、熊果酸的含量，結果見表2。

3 討論

3.1 提取方法的選擇，對提取溶劑和提取方法進行了考察，選用甲醇、乙醇、乙醚作為提取溶劑，進行了索氏提取、回流提取、超聲提取，結果顯示，甲醇和乙醇超聲提取30min即可，但考慮到成本及試劑的毒性，最終選擇乙醇作為提取溶劑，方法操作簡便、快捷。

3.2 本實驗對來自不同產地枇杷樹的莖枝及葉中齊墩果酸、熊果酸含量進行測定。結果表明，不同產地的枇杷樹中齊墩果酸、熊果酸的含量差異較大，其中以采自廣西欽州市的齊墩果酸、熊果酸含量最高，同一產地枇杷樹中同一部位齊墩果酸、熊果酸含量不同，熊果酸含量比齊墩果酸高，同一產地枇杷樹中不同部位齊墩果酸、熊果酸含量不同，莖枝比葉含量高。本實驗所建立的含量測定方法可同時測定枇杷樹莖枝和葉中熊果酸和齊墩果酸的含量，具有準確、靈敏、快捷的特點，為對其進一步開發利用提供理論依據。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典第一部［S］.2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：1067-1068.

［2］郭宇，吳松吉，樸惠善.枇杷葉的化學成分及藥理活性研究進展［J］.時珍國醫國藥，2006，17(6)：928-930.

［3］杜豐玉，陳鈞，宣寒，等.RP-HPLC測定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸［J］.中成藥，2006，28(12)：1790-1793.

［4］羅曉清，郭小儀，俞學煒.RP-HPLC法測定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸［J］.中國野生植物資源，2004，23(5)：50-51.