補腎益髓方對骨質疏松癥大鼠腎PKC蛋白表達的影響

孫 鑫，鄧洋洋，燕 燕，王思程，尚德陽，李 楠，鄭洪新

(遼寧中醫藥大學，沈陽 110032)

骨質疏松癥(Osteoporosis OP)是以骨量減少、骨組織微細結構破壞為特征，繼而導致骨脆性增加和骨折危險性增高的1種全身性骨骼疾病［1］。本病發病機制尚未闡明，其發生與諸多因素有關。

中醫認為，腎主骨骨病首責于腎，“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也;髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內，髓足者則骨強”(清·唐宗海《中西匯通醫經精義·臟腑所合》)。因此，本實驗對骨質疏松癥大鼠腎組織PKCα與PKCβ2蛋白表達進行研究，旨在探索骨質疏松癥的發病機制以及補腎益髓中藥的防治作用。

1 材料

1.1 動物

清潔級雌性4～5月齡 wistar大鼠169只，體重230g～270g，由中國醫學科學院實驗動物中心提供。

1.2 藥物

實驗藥品:補腎壯骨益髓中藥(牡蠣、鹿茸等)。對照藥品:骨疏康顆粒劑(遼寧康辰藥業有限公司)、蓋天力片(東盛科技啟東蓋天力制藥股份有限

2公司)、健脾中藥補中益氣湯方(遼寧中醫藥大學附屬醫院藥房提供)。

1.3 試劑

兔抗 PKCα一抗(Santa Cruz)，兔抗 PKCβ2一抗(Santa Cruz)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG(北京中山生物公司)，堿性磷酸酶(ALP)偶聯的羊抗兔抗體(北京中山生物公司)。

2 方法

2.1 動物分組

1組:正常組;2組:假手術組;3組:模型組;4組:補腎中藥低劑量組(低劑量組);5組:補腎中藥高劑量組(高劑量組);6組:補中益氣湯對照組(健脾組);7組:蓋天力鈣片對照組(蓋天力組);8組:骨疏康顆粒對照組(骨疏康組)。

2.2 造模方法

手術摘除大鼠雙側卵巢的方法建立骨質疏松癥模型。假手術組大鼠僅切開皮膚及皮下組織暴露雙側卵巢，但不摘除。正常組不手術。

2.3 飼養方法

正常組及假手術組大鼠正常飲水，其他各組大鼠正常飲水的同時給予相應的藥物灌胃，每日1次，共3個月。大鼠等效劑量按成人每日用藥量的6.3倍計算，容積為0.875ml/100g體重。

2.4 取材

實驗大鼠在最后1次灌胃后，禁食24h后取材。大鼠經10%水合氯醛注射麻醉(0.3ml/100g體重)后，用碘伏消毒手術部位并采集標本。本實驗保留標本包括腎(置高壓滅菌 EP管內 －70℃保存)、左后肢股骨(置塑料保鮮袋內 －70℃冰箱凍存)、子宮(稱取濕重)。

2.5 統計方法 統計軟件SPSS11.5方差分析法，結果以均數±標準差(x珋±s)表示。

3 結果

3.1 動物模型評價

(1)骨密度 通過雙能X線骨密度分析儀(附帶“The Small Subject Scout Scan”軟件)對大鼠離體股骨進行檢測(掃描寬度15cm，長度可任意調節，掃描速度40mm/sec，分辨率為1.0×1.0 mm;結果采用單位面積內的骨礦物質含量(g/cm2)表示)，通過統計所得結果如下。與正常組比較，模型組大鼠股骨頭骨密度顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，補腎中藥高劑量組可顯著增加骨密度(P＜0.01)，而健脾中藥作用不明顯，與補腎中藥高劑量組差異顯著(P＜0.01);(2)子宮指數:實驗大鼠子宮指數統計結果顯示，與正常組、假手術組相比較，模型組子宮指數明顯降低(P＜0.01);(3)大鼠行為學指標:正常組大鼠皮毛光澤、活潑喜動、反應靈敏、食欲佳、無豎毛、弓背、聚堆等表現。模型組大鼠均出現弓背塌腰表現，其他表現如毛色變淡、蜷縮、聚堆、反應遲鈍、喜靜懶動、抗應激能力下降等癥狀不十分明顯，補腎中藥高劑量組、補腎中藥低劑量組及陽性對照組的弓背塌腰表現較模型組為輕。用藥各組弓背塌腰癥狀改善率為:低劑量組33.3%，高劑量組52.4%，健脾組15.8%，蓋天力組30%，骨疏康組25%。

表1各組大鼠左后肢離體股骨骨密度比較(±s)

表1各組大鼠左后肢離體股骨骨密度比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05;與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，與模型組比較:##P＜0.01;與低劑量比較:●P＜0.05;與低劑量比較:●●P＜0.01;與高劑量比較:☆P＜0.05，與高劑量比較:☆☆P＜0.01

組 別 例數 全股骨骨密度(g/cm2)正 常 組15 0.16433±0.01466##假 手 術 組 17 0.15582±0.01138##模 型 組 21 0.14700±0.01035＊＊低 劑 量 組 21 0.15186±0.01285＊＊☆高 劑 量 組 21 0.16095±0.01593##●健 脾 組 19 0.14211±0.01127＊＊●☆☆骨 疏 康 組 20 0.14835±0.01483＊＊☆☆蓋 天 力 組 20 0.15695±0.00778#

表2各組藥物對腎虛骨質疏松大鼠子宮指數影響的比較(±s)

表2各組藥物對腎虛骨質疏松大鼠子宮指數影響的比較(±s)

注:同表1

組別 例數 子宮指數正 常 組 15 2.0434±0.7178##假 手 術 組 17 1.8195±0.4311##模 型 組 21 0.2859±0.0469＊＊低 劑 量 組 21 0.2930±0.0501＊＊高 劑 量 組 21 0.3110±0.0694＊＊健 脾 組 19 0.2773±0.0435＊＊骨 疏 康 組 20 0.2835±0.0170＊＊蓋 天 力 組 20 0.2888±0.0684＊＊

從以上結果分析，本次實驗骨質疏松癥大鼠模型造模成功，且以弓背塌腰癥狀為腎虛模型的表征信息，補腎各組優于其他各模型組。

3.2 實驗大鼠腎組織 PKCα及 PKCβ2的蛋白表達情況

3.2.1 實驗大鼠腎組織 PKCα蛋白表達情況

表2顯示，正常組與假手術組無差異;與正常組相比較，低劑量組無差異，而其他各組均存在顯著差異(P＜0.01);與模型組相比較，正常組、假手術組、低劑量組、高劑量組存在顯著差異(P＜0.01)，補脾組及蓋天力組有差異(P＜0.05)，骨疏康組無差異;與低劑量組相比較，正常組及假手術組無差異，模型組及其他各用組均存在顯著差異(P＜0.01);與高劑量組相比，其他各組均存在顯著差異(P＜0.01)(圖1-1)。

3.2.2 實驗大鼠腎組織 PKCβ2的蛋白表達情況 表2顯示，正常組與假手術組無差異;與正常組相比較，低劑量組無差異，而其他各組均存在顯著差異(P＜0.01);與模型組相比較，正常組、假手術組、低劑量組、高劑量組存在顯著差異(P＜0.01)，補脾組、骨疏康組及蓋天力組無差異;與低劑量組相比較，正常組及假手術組無差異，模型組及其他各用組均存在顯著差異(P＜0.01);與高劑量組相比，其他各組均存在顯著差異(P＜0.01)(圖2-1)。

圖1 蛋白表達電泳圖(Western blotting法)

圖2 蛋白表達電泳圖(Western blotting法)

4 討論

4.1 骨質疏松癥動物模型的選擇

本實驗采用的骨質疏松癥模型是一種比較成熟的模型，美國國立衛生研究院、世界衛生組織都推薦用此模型作為研究骨質疏松的最佳模型。大鼠分布廣，繁殖快，生命周期短，便于飼養，費用較低，是目前研究骨質疏松使用最多、最成熟的造模動物。Wistar大鼠具有對傳染病的抵抗力較強，自發性腫瘤發生率低等特點，十分適合用來進行與老年性疾病相關的實驗。

在本實驗中通過觀察發現，去卵巢動物模型術后早期階段出現了弓背塌腰的表現，是典型的腎虛癥狀，應用補腎中藥后這些癥狀緩解或消失，由此我們認為此模型屬腎虛，腎虛不能生髓，則髓減，使骨失所養，骨枯髓減導致“骨痿”。

4.2 骨質疏松癥與腎的關系

中醫認為，腎主骨，骨病首責于腎。腎虛可能是骨質疏松癥發生的病機之一。“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也;髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內.髓足者則骨強”(清·唐宗海《中西匯通醫經精義-臟腑所合》)。腎虛的機制是復雜的。本實驗選取腎組織進行指標檢測，一方面是探討骨質疏松的發病機制及其治療，另一方面可以為研究腎虛的機制提供生物學依據。

4.3 PKC與骨質疏松癥的研究

蛋白激酶C(PKC)是1977年在鼠腦的胞質成分中發現的一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶，由多種同工酶亞型組成，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員之一，以其活性依賴于Ca2+而得名，參與多種生命活動，如蛋白磷酸化、信號傳遞、細胞增殖和分裂、跨膜離子轉運、平滑肌收縮、基因表達等。［2］本實驗選取PKCα與PKCβ2作為研究對象，應用補腎益髓中藥對模型大鼠進行干預。

1997年崔家鵬等對腎虛骨質疏松癥大鼠紅細胞膜PKC的活性進行了研究。結果表明，腎虛骨質疏松癥模型大鼠紅細胞膜PKC的活性明顯降低，經密骨靈治療組模型大鼠與正常組接近［3］。2003年谷野等進行的體外實驗表明，含密骨顆粒劑的血清可使UMR106成骨樣細胞中PKC活性增強，且主要以cPKCβ為主，并能促進成骨樣細胞的增殖。成骨細胞是骨代謝過程中的重要細胞，它的增殖有利于骨的形成［4］。

4.4 本實驗研究結果的討論

與正常組比較，模型組大鼠腎組織PKCα、β2蛋白表達顯著降低(P＜0.01)，表明腎組織中PKC蛋白表達的變化與腎虛骨質疏松癥的病理機制密切相關。腎組織中PKCα、β2蛋白表達降低，是腎虛骨質疏松癥的病理機制之一，也是腎虛的病理機制之一。

補腎中藥(低劑量)、補腎中藥(高劑量)能夠顯著上調腎虛骨質疏松癥模型大鼠腎組織 PKCα、PKCβ2蛋白表達(P＜0.01)，補脾中藥、蓋天力能夠提高腎虛骨質疏松癥模型大鼠腎組織PKCα蛋白表達(P＜0.05)，但對于 PKCβ2蛋白表達的升高無統計學意義，說明以上幾種藥物均有一定的療效，但補腎中藥效果優于其他幾種對照藥，說明補腎中藥可以通過上調腎虛骨質疏松癥模型大鼠腎組織PKCα、PKCβ2蛋白表達而起到調整腎虛骨質疏松癥的作用。

在本次實驗中，補腎中藥的實驗結果接近正常組，其它用藥組與正常組存在顯著差異，補腎中藥防治骨質疏松的效果優于健脾中藥等其他各組藥物，一方面說明補腎中藥的有效性，另一方面根據中醫以藥驗證的理論說明本實驗骨質疏松動物模型屬腎虛證。

［1］劉忠厚.骨質疏松學［M］.北京:科學出版社，1998:142.

［2］陳敏，唐建武.PKC亞型的生物學特性與調節功能［J］.國外醫學·生理病理科學與臨床分冊，2002，22(5):493-496.

［3］谷野，鄭洪新.含密骨顆粒劑血清對 UMR106成骨樣細胞增殖及 PKC活性的影響［J］.遼寧中醫雜志，2003，30(7):575-577.

［4］崔家鵬，鄭洪新，劉景峰，等.補腎中藥對腎虛骨質疏松癥大鼠紅細胞膜PKC、Ca2+-Mg2+ATP酶活性影響的實驗研究［J］.中國骨質疏松雜志，1997，3(3):66-69.