斯氏并殖吸蟲(chóng)抗原致大鼠腦組織病變的光鏡、電鏡觀察＊

黃玉清，李珍煉，陳文碧，佘俊萍，楊朝鮮，程基焱，王光西

2.瀘州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，瀘州 646000；

3.瀘州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)科研中心，瀘州 646000

斯氏并殖吸蟲(chóng)散在流行于我國(guó)四川、重慶、甘肅、福建等15個(gè)省、市、自治區(qū)，是重要的食源性寄生蟲(chóng)病病原體，由于人不是斯氏并殖吸蟲(chóng)的正常宿主，童蟲(chóng)不能在人體內(nèi)發(fā)育至性成熟產(chǎn)卵，很少進(jìn)入肺臟形成典型囊腫［1］。因生食或半生食含囊蚴的溪蟹而感染，童蟲(chóng)鉆過(guò)腸壁移行至皮下或組織器官，引起游走性皮下結(jié)節(jié)，還侵犯腦和脊髓，引起顱內(nèi)占位、破壞、出血、水腫，可表現(xiàn)為癲癇、偏癱等，嚴(yán)重者可終身殘疾［2］。蟲(chóng)體移行的機(jī)械破壞作用、代謝分泌物等抗原的致敏作用是其主要致病機(jī)制。

本文通過(guò)腦立體定位儀微量注射斯氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原至大鼠大腦皮質(zhì)，模擬肺吸蟲(chóng)腦病大鼠模型，通過(guò)光鏡和電鏡觀察病理變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重（360±20）g，共6只，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 多聚甲醛，骨蠟購(gòu)自上海三友外科器械有限公司；二甲苯、中性多聚甲醛、無(wú)水乙醇購(gòu)自四川航嘉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 腦立體定位儀（NARISHIGESN－3型，日本）；透射電子顯微鏡（JEM－1400，日本）；超薄切片機(jī)（萊卡2150）。

1.2 方法

1.2.1 獲取斯氏并殖肺吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，制備抗原 采取斯氏并殖吸蟲(chóng)病流行區(qū)溪蟹；研碎、多次換水沉淀至清；解剖顯微鏡下分離獲取囊蚴，鑒定為斯氏并殖吸蟲(chóng)囊蚴，采用腹腔注射法感染家犬，每只犬注射200個(gè)囊蚴，共感染3只犬，飼養(yǎng)觀察3個(gè)月。解剖犬，無(wú)菌條件下從犬肺及肝蟲(chóng)囊中取出成蟲(chóng)。蟲(chóng)體經(jīng)滅菌生理鹽水洗凈、剪碎、干燥、研磨、脫脂，再經(jīng)冷浸；3 000 r/min離心，取上清，測(cè)其蛋白含量6.735 mg/mL，分裝冰箱（－20℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大鼠并殖吸蟲(chóng)腦病模型［3］實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各3只大鼠，用1%的戊巴比妥鈉用腹腔注射麻醉，實(shí)驗(yàn)組：腦立體定向儀下15 min內(nèi)緩慢注射并殖吸蟲(chóng)抗原50μL，在無(wú)菌條件下進(jìn)行；飼養(yǎng)觀察24 h。

1.2.3 大鼠的灌注固定和腦組織取材 大鼠麻醉后，開(kāi)胸，灌注4℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液400～600 m L，以進(jìn)針中心取鼠腦，置入10%中性福爾馬林液中固定。

1.2.4 組織病理學(xué)觀察 取腦組織，經(jīng)固定、石蠟包埋，4 μm切片后常規(guī)脫水、蘇木素－伊紅染色、脫水透明、封片鏡檢。

1.2.5 電鏡觀察 將腦組織置4%戊二醛液固定1 h；以0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，每次30 min；后用1%四氧化鋨固定1 h，同樣方法沖洗3次；丙酮系列脫水，丙酮：包埋劑Epon 8l2環(huán)氧樹(shù)酯（1∶1和1∶2）與純包埋劑系列滲透，包埋聚合；超薄切片；經(jīng)鈾鉛雙重染色；在電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡檢查

2.1.1 正常對(duì)照組 大鼠腦神經(jīng)元和尼氏小體完整，見(jiàn)圖1。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)組 大鼠腦血腫周?chē)X組織水腫明顯（組織疏松、細(xì)胞間隔增寬），且局灶狀壞死；毛細(xì)血管輕度增生、充血；神經(jīng)元皺縮，尼氏小體溶解，周?chē)霈F(xiàn)間隙，神經(jīng)突呈淺淡或消失；可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，見(jiàn)圖2。

2.2 電鏡觀察

2.2.1 對(duì)照組 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元核仁清晰，核膜完整；染色質(zhì)均勻，線粒體無(wú)腫脹，線粒體嵴結(jié)構(gòu)正常；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)組 大腦皮質(zhì)可見(jiàn)暗細(xì)胞。大腦皮質(zhì)中神經(jīng)元胞體腫脹，核移位且形狀不規(guī)則，核膜凸凹不平、模糊、斷續(xù)甚至溶解消失，核質(zhì)溢出；常染色質(zhì)為不均勻的絮狀，異染色質(zhì)多，呈濃密的團(tuán)塊狀，核仁絨球形；線粒體電子密度增高，腫脹，嵴斷裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈囊泡化；高爾基復(fù)合體扁囊擴(kuò)張、結(jié)構(gòu)紊亂；溶酶體少見(jiàn)；脂褐素、糖原較多；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核核膜清晰，異染色質(zhì)多，見(jiàn)圖3－5。

圖1 對(duì)照組鼠腦組織神經(jīng)元和尼氏小體完整，HE×100Fig.1 Intact neurons and nissl in rat brain in normal group，HE×100

圖2 實(shí)驗(yàn)組鼠腦皮質(zhì)H神經(jīng)元固縮，HE×200Fig.2 Cortex neuron pyknosis in rat brain in antigen injection group，HE×200

3 討 論

圖3 實(shí)驗(yàn)組鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核水腫（A），染色質(zhì)溶解（C），核膜（D），核仁（b）形態(tài)正常，核周間隙（E）清晰，細(xì)胞器大面積水腫，線粒體水腫，嵴破壞（F），×10000Fig.3 Cerebral cortical neurons in the nucleus edema（A），the chromatin solution （C），the nuclear membrane（D），nucleolus（B），perinuclear space（E），and cristae damage（F）in the rat brain in antigen injection group，×10 000

圖4 實(shí)驗(yàn)組鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張（A），脂褐素明顯（B），×15000Fig.4 Neurons in the endoplasmic reticulum expansion（A），and significant lipofuscin（B）in rat brain cortex in antigen injection group，×15 000

肺吸蟲(chóng)的致病主要由童蟲(chóng)及成蟲(chóng)的機(jī)械性損傷及蟲(chóng)體代謝產(chǎn)物等抗原物質(zhì)導(dǎo)致的免疫病理反應(yīng)引起，臨床表現(xiàn)多樣，有胸肺型、皮膚型、腦脊髓型、腹型、肝型、心包型、眼型、陰囊腫塊型、亞臨床型［4］。斯氏并殖吸蟲(chóng)童蟲(chóng)移行侵入腦內(nèi)，包括腦膜、脊髓膜、腦實(shí)質(zhì)，造成腦型肺吸蟲(chóng)病。臨床多表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、嘔吐、頸強(qiáng)直及顱內(nèi)高壓癥狀與局限性神經(jīng)體征，難與腦膜炎、腦腫瘤準(zhǔn)確區(qū)分。有關(guān)肺吸蟲(chóng)引起腦損傷的機(jī)制報(bào)道不多。由于很難取得并殖吸蟲(chóng)對(duì)腦組織損害標(biāo)本，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腦立體定位儀微量注射并殖吸蟲(chóng)抗原至大鼠大腦皮質(zhì)，模擬并殖吸蟲(chóng)損傷腦組織；在光鏡、電鏡觀察其所致的病理變化。實(shí)驗(yàn)鼠腦組織水腫明顯，且局灶狀壞死，神經(jīng)元皺縮，尼氏小體溶解，神經(jīng)突呈淺淡或消失，可見(jiàn)單核細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。表明斯氏并殖吸蟲(chóng)腦病模型大鼠腦組織有嚴(yán)重炎癥病理反應(yīng)。電鏡觀察到抗原注射大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞體腫脹，核移位且形狀不規(guī)則，核膜凸凹不平，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脂褐素較多。表明肺吸蟲(chóng)抗原注射大鼠腦可引起腦組織超微結(jié)構(gòu)改變：細(xì)胞腫脹，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。肺吸蟲(chóng)的機(jī)械破壞和細(xì)胞毒素抗原等炎癥分子，引起大鼠腦組織和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病理改變。

圖5 實(shí)驗(yàn)組鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體（B）水腫嵴斷裂、空泡化，細(xì)胞核不規(guī)則，核膜溶解，凹凸不平（A）×10 000Fig.5 Mitochondria edema crest fracture（B），vacuolization，nuclear irregularity，nuclear membrane dissolves，uneven surfaces（A）in rat brain cortex in antigen injection group，×10 000

［1］Liu Q，Wei F，Liu W，et al.Paragonimiasis：an important foodborne zoonosis in China［J］.Trends Parasitol，2008，24（7）：318－323.DOI：10.1016/j.pt.2008.03.014

［2］Lee JC，Cho GS，Kwon JH，et al.Macrophageal/microglial cell activation and cerebral injury induced by excretory－secretory products secreted byParagonimuswestermani［J］.Neurosci Res，2006，54（2）：133－139.DOI：10.1016/j.neures.2005.11.001

［3］Yang CX，Zhou L，Gao XQ，et al.The expression and significance of proliferating cell nuclear antigen in brain tissue of rats following experimental intracerebral hemorrhage［J］.Chin J Neuroanat，2008，24（5）：533－537.（in Chinese）.

楊朝鮮，周玲，高小青，等.增殖細(xì)胞核抗原在實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦組織中的表達(dá)及其意義 ［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2008，24（5）：533－537.

［4］Shen YP，Shao XY，Li YS，et al.Practical paragonimiasiology［M］.2nd ed，Beijing：People＇s Medical Publishing House，2008：124－129.（in Chinese）

沈一平，邵向云，李友松，等.實(shí)用肺吸蟲(chóng)病學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社.2008：124－129.