單個核細胞源性血管內皮生長因子在急性心肌梗死患者中的動態變化及意義

洪蒼浩 湯國法 劉曉紅

武鋼集團鄂鋼醫院心內科，湖北鄂州 463002

血管內皮生長因子在缺血性心臟病發病機制中起著重要作用，動脈粥樣硬化的形成，冠狀動脈成形術后再狹窄都與生長因子參與的細胞增殖、遷移、分化與凋亡有密切關系。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種特異作用于血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）強有力的有絲分裂原，在缺血、缺氧及血管損傷時能促進VEC增殖、遷移及誘導血管生成，是迄今所發現最強的一種血管內皮生長因子。由于冠心病是以心肌缺血為主要特征，外源性VEGF已成為目前促血管生成、重建冠狀動脈側枝循環的研究熱點。目前，在應用外源性VEGF基因轉染治療心肌缺血方面研究很多，而對不同來源的內源性VEGF在心肌缺血時所起的作用研究甚少。本研究通過觀察AMI患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分泌的VEGF水平的動態變化來探討不同來源的內源性VEGF在AMI患者中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者為2010年1月～2011年6月筆者所在醫院心血管內科住院確診的急性心肌梗死患者28例，其中男20例，女8例，平均年齡（58.7±7.9）歲。12例正常體檢者作對照，其中男9例，女3例，平均年齡（55.6±6.3）歲。28例AMI患者均進行了冠脈造影（coronary angiography，CAG），并實施經皮腔內冠狀動脈球囊擴張和支架植入術（percutaneous transluminal coronary angioplasty and stent，PTCA+stent），所有患者均常規服用阿司匹林和氯吡格雷，并根據醫生建議服用β-受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等藥。28例患者CAG檢查結果：單支血管病變11例，2支血管病變9例，3支血管病變8例。合并高血壓病的有15例（54%），高脂血癥23例（82%），糖尿病7例（25%），18例患者有吸煙史（64%），8例有冠心病家族史（28%）。

1.2 急性心肌梗死的診斷

根據WHO標準持續典型的胸痛30 min以上；典型心電圖動態變化；心肌酶（肌酸磷酸激酶及其同工酶MB或肌鈣蛋白）動態變化。具有以上中任何2項即可確診。

1.3 正常對照者入選條件

對照組與AMI組進行性別、年齡配對，經病史詢問無心血管疾病史，體格檢查無陽性體征，胸片、心電圖、肝腎功能、生化常規檢查無異常者。合并嚴重心衰、肝、腎功能衰竭、感染性疾病、腫瘤、外周血管病、腦卒中者予以剔除。

所有患者在發病2 d內進行床旁心臟彩色多普勒超聲檢測左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF），半月后（出院時）復查LVEF（由心臟彩超室專人質控檢測）。

1.4 主要儀器和試劑

CO2培養箱：美國Formal Scientific公司；Lympus倒置顯微鏡：日本；酶聯免疫檢測儀：美國EL312eVEGF酶聯免疫檢測試劑盒：北京晶美生物工程有限公司（進口分裝），檢測靈敏度為30 pg/mL，批內、批間誤差均＜9.5%；淋巴細胞分離液：Ficoll-Hypaque液，中科院血液研究所；PBS液：新鮮配制；RPMI-1640：GIBCO，美國；小牛血清：筆者所在醫院中心實驗室制備；雙抗：青霉素100 IU/mL，鏈霉素100μg/mL。

1.5 研究方法

1.5.1 外周血單個核細胞（PBMCs）的分離和培養及標本的提取

1.5.1.1 PBMCs的分離 （1）在AMI患者發病的第1、5、10、15天分別抽取20 mL靜脈血放入肝素抗凝離心管內，搖勻，用PBS液稀釋血液1倍，對照組僅抽1次靜脈血。（2）取淋巴分離液4 mL，放入15 mL離心管中。（3）將稀釋全血沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液重疊于淋巴分離液上，稀釋血液與分離液體積之比約為2∶1。（4）用水平離心機以2 000 rpm離心20 min，離心后，單個核細胞位于血漿和淋巴分離液界面層。（5）吸取界面單個核細胞層，用PBS洗滌3次，每次1 500 rpm離心10 min，吸棄上清，加入1 mL RPMI 1640，混勻，細胞計數，用苔盼藍染色，計算活細胞數，均＞95%。

1.5.1.2 PBMCs的培養 （1）用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液重懸單個核細胞，并將細胞濃度調節至5×106/mL。（2）取1 mL濃度為5×106/mL PBMCs懸液放入24孔培養板中，在37℃，5%CO2條件下于培養箱中進行細胞培養。

1.5.1.3 標本的提取 分別于6、12、24 h收取PBMCs培養的上清液，置-70℃冰箱保存待測。

1.5.2 血清肌酸磷酸激酶（CK）最大值的測定 AMI患者發病后每4 小時測1次CK直到最大值（由檢驗科專人質控檢驗）。

1.5.3 VEGF的測定 外周血單個核細胞培養分泌的VEGF量均采用雙抗夾心酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定，濃度單位為pg/mL。按試劑盒說明進行操作。

1.6 統計學處理

應用SPSS17.0軟件包進行統計分析，主要統計指標均進行正態性檢驗，對于偏態分布的計量資料，對數轉換達到近似正態分布后，再進行比較。各統計指標均以（± s）表示。采用直線相關分析法分析相關指標間相關性，計量資料的組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBMCs產生的VEGF水平的動態變化

PBMCs培養產生的VEGF水平在不同培養時間段呈動態變化，用“PBMC-VEGF”表示PBMCs培養產生的VEGF水平。為了便于觀察，首先對AMI發病第1天分離的PBMCs培養產生的VEGF進行統計分析。見表1。從表中可見PBMCVEGF水平隨著培養時間的延長而逐漸增加，在12 h和24 h時均顯著高于對照組（P＜0.05）。取培養24 h的PBMCs產生的VEGF量作為觀察PBMCs分泌VEGF能力的統計指標。AMI患者從發病第1～15天，PBMC-VEGF水平呈動態變化。見表2。從表中可見，AMI組PBMC-VEGF水平從發病第1天開始升高，在第5天達峰值為（343.2±82.5）pg/mL，顯著高于對照組的（143.3±24.2）pg/mL（P＜0.05）。隨后呈下降趨勢，但仍顯著高于對照組，到發病第15天PBMC-VEGF水平仍顯著高于對照組（P＜0.05）。

表1 AMI患者第1天PBMC-VEGF水平的變化（± s，pg/mL）

表1 AMI患者第1天PBMC-VEGF水平的變化（± s，pg/mL）

注：與對照組同時間比較，*P＜0.05

組別 n 6 h 12 h 24 h對照組 12 78.5±22.1 95.3±27.0 143.3±24.2 AMI組 28 104.3±22.5 159.2±31.6* 206.0±43.7*

表2 AMI患者PBMC-VEGF水平的變化（n，pg/mL）

2.2 VEGF與心肌酶CK的相關性

AMI患者心肌酶峰值CK為929.8～3 827.2 IU/L，平均（2 185.9±320.3）IU/L。為了探討VEGF水平與急性心肌梗死時心肌酶升高的關系，對外周血單個核細胞PBMC-VEGF水平與CK峰值進行線性相關分析，PBMC-VEGF峰值與CK無顯著相關性。

2.3 VEGF水平與左室收縮功能的關系

為了探討VEGF水平與左室收縮功能（LVEF）的關系，將入院時LVEF水平（52.3±2.6）%與半月后（出院時）復查的LVEF水平（52.7±2.8）%進行比較，結果兩者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。將LVEF水平分成兩組，A組為AMI患者半月后復查時LVEF水平不低于入院時LVEF水平，有12例，B組為AMI患者半月后復查時LVEF水平低于入院時LVEF水平，有16例，然后分別比較A、B兩組PBMC-VEGF水平之間的關系。見表3。

表3 AMI患者VEGF水平與左室收縮功能的關系（± s）

表3 AMI患者VEGF水平與左室收縮功能的關系（± s）

注：與B組比較，*P＜0.05

組別 n LVEF（%） PBMC-VEGF（pg/mL）A組 12 55.6±2.7* 867.6±113.1*B組 16 50.8±2.1 34.8±82.4

3 討論

VEGF是現今發現的眾多血管生長因子中最有力的血管生成因子，VEGF通過與細胞表面的特異受體結合而發揮作用，目前發現有3種特異受體分別為flt-1、flk-1/KDR和flt-4，屬酪氨酸激酶受體家族第三亞型[1]，其中flt-1和flt-1/KDR主要在血管內皮細胞表達，在人的冠狀動脈內皮細胞和心肌細胞中均有高水平表達，提示VEGF在心血管系統的功能主要以旁分泌和自分泌的形式實現[2]。

本研究發現，從AMI患者外周靜脈血中分離出的單個核細胞能分泌VEGF，PBMCs分泌的VEGF在AMI后即呈上升趨勢，于心梗后第5天上升到最高峰，隨后10 d內仍維持高值狀態，且顯著高于對照組，但PBMCs分泌VEGF的高峰值與心肌酶CK高峰值無顯著相關性。從以上結果可見，AMI后，由PBMCs產生的VEGF水平迅速上升，目前，鮮有此類報道，其發生機制尚不清楚，可能與AMI發生后，產生VEGF的PBMCs的種類發生改變和（或）其分泌VEGF的功能得以加強有關，其發生機制有待進一步研究。Zhao等[3]發現，心肌梗死處VEGF mRNA基因表達在AMI后2 h就迅速增高，12 h達高峰。引起VEGF表達增加的原因是多方面的。以上結果顯示，心肌缺血、缺氧可能是刺激心肌細胞VEGF迅速高表達并在特定時間內持續的主要始動因素，AMI后分泌的生物活性物質可能是AMI亞急性期VEGF持續高表達，并維持一定時間的原因之一[4]。

在研究VEGF水平與AMI患者左室收縮功能關系時發現，左室收縮功能有改善的AMI患者，其PBMC-VEGF水平顯著高于左室收縮功能下降的AMI患者。推測AMI患者左室收縮功能的改善可能與PBMCs產生的內源性VEGF在參與修復損傷血管內皮和促進血管生成方面有密切關系。VEGF是迄今所發現最強的一種血管內皮生長因子，能特異地作用于靶細胞－VEC，促進其有絲分裂及血管形成。Zhao等[3]發現，梗死區有VEGF mRNA的表達，同時伴有血管密度高水平表達可持續7 d以上，提示VEGF可能參與心肌梗死的血管重建。Wu等[5]研究發現重組VEGF基因能改善AMI患者的左室收縮功能，局部梗死區心肌室壁異常運動也明顯改善。以上結果顯示，通過有效方法使特定部位的內源性VEGF基因和蛋白表達升高到一定程度，就能充分發揮其促血管生成，增加缺血心肌灌注，改善AMI患者左室收縮功能。

單個核細胞不但能分泌VEGF，且能介導VEGF對炎性細胞的趨化反應，與炎性細胞在血管生成中的作用有關[6]。Ripa等[7]發現，冠心病患者建立側支循環以改善進行性冠脈狹窄的能力與單核細胞缺氧時產生的VEGF mRNA的能力有關，建立側支循環的患者與沒有建立側支循環的患者相比，單核細胞缺氧時VEGF mRNA表達水平有顯著差異。以上結果提示，急性心肌梗死時，單個核細胞趨化、粘附在損傷的血管內皮部位，促使內源性VEGFm RNA高表達及VEGF蛋白大量生成，發揮VEGF促內皮細胞分裂、增殖、修復血管內皮和促進缺血區側枝循環的建立等作用，增加缺血區血流灌注，抑制缺血、梗死范圍的進一步擴大，達到改善心臟收縮功能的作用。推測在AMI發生時，通過促進粘附在冠狀動脈內皮損傷處PBMCs產生的VEG FmRNA高表達，可達到改善AMI患者心功能目的，詳細的機制有待更深入的研究。

在AMI患者急性期，由PBMCs產生的VEGF在改善左室收縮功能方面可能起重要作用。

[1]Miura S，Matsuo Y，Saku K.Transactivation of KDR/Flk-1 by the B2 receptor induces tube formation in human coronary endothelial cells[J].Hypertension，2003，41（5）：1118-1123.

[2]Korpisalo P，Yl-Herttuala S.Stimulation of functional vessel growth by gene therapy[J].Integr Biol （Camb），2010，2（2）：102-112.

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[5]Wu G，Rana JS，Wykrzykowska J，et al. Exercise-induced expression of VEGF and salvation of myocardium in the early stage of myocardial infarction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296（2）：H389-H395.

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[7]Ripa RS，Jrgensen E，Baldazzi F，et al.The influence of genotype on vascular endothelialgrowth factor and regulation of myocardial collateral blood flow in patients with acute and chronic coronary heart disease[J]. Scand J Clin Lab Invest，2009，69（6）：722-728.