γ－氨基丁酸A受體及受體基因在大鼠急性腦缺血中的變化

張俊清

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科 包頭 014010

氨基酸類遞質(zhì)在腦缺血損傷中發(fā)揮了重要作用。其中抑制性氨基酸（IAAs）遞質(zhì)具有突觸前及突觸后抑制功能，有對抗興奮性氨基酸的毒性的作用，具有腦保護(hù)功能。目前研究表明，γ－氨基丁酸（GABA）具有很高的生理活性，與許多神經(jīng)、精神疾病有關(guān)［1］。GABA可阻斷Glu興奮性毒性，抑制細(xì)胞膜去極化和Ca2＋內(nèi)流，具有神經(jīng)保護(hù)作用。GABA的作用是通過與其受體結(jié)合來發(fā)揮的，介導(dǎo)GABA作用的受體主要有三種不同類型，即GABAA、GABAB、GABAC受體，其中以GABAA受體分布最為廣泛，GABAA受體屬促離子型受體，是由不同的亞單位構(gòu)成的CL－通道。GABAA受體為突觸后膜上的受體，在腦缺血中發(fā)揮重要的保護(hù)作用，許多研究表明，GABAA受體具有抵抗缺血缺氧，有助于神經(jīng)元存活和功能重建的作用。GABAA受體主要是由α、β和γ亞基組成。其中α亞基對GABAA受體復(fù)合物的組裝及功能可能起主要作用。GABAAR功能障礙與多種神經(jīng)和精神疾病，如腦缺血、癲癇、焦慮、抑郁、疼痛等有關(guān)［2］。對GABAA型受體及GABAARα1 mRNA的研究，目前多集中在癲癇、抑郁癥［2－4］等方面，在腦缺血損傷中比較少。該項(xiàng)研究對大鼠腦缺血不同時(shí)期腦組織中GABAA受體及GABAARα1 mRNA進(jìn)行檢測，來觀察γ－氨基丁酸A型受體及受體基因在腦缺血損傷中的動態(tài)變化規(guī)律及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康雄性大白鼠45只，重量為300 g左右。將動物隨機(jī)分組，分別為：正常對照組，腦缺血1 h、6 h、24 h、3 d組（手術(shù)組）和假手術(shù)組，每組5只。

1.2 方法 （1）動物模型制作：采用改良的右側(cè)大腦中動脈線栓法（MCAO）。（2）免疫組化法檢測：GABAAR采用鏈酶親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物法染色（SABC法）。（3）GABAARα1 mRNA的檢測采用原位雜交法。（4）觀察項(xiàng)目和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：在高倍顯微鏡視野下計(jì)數(shù)各組腦組織大腦皮質(zhì)GABAAR及GABAARα1 mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)及觀察其陽性神經(jīng)元表達(dá)的改變。采用形態(tài)分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，測量陽性神經(jīng)元數(shù)目。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)改變 神經(jīng)元形態(tài)學(xué)在光鏡下觀察，正常對照組和假手術(shù)組無異常，陽性細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色；手術(shù)組部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了壞死前樣改變，包括細(xì)胞核濃縮、胞漿著色變淡、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，損傷重的組織內(nèi)可見液化壞死灶，灶內(nèi)神經(jīng)元?dú)埓孑^少或缺失。

2.2 陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)情況

2.2.1 GABAAR陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較：與對照組相比，各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)對照組神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)均無明顯改變（P＞0.05）；與假手術(shù)組相比較，缺血組神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)于腦缺血后1 h即有降低，6 h降至最低，故GABAAR表達(dá)于腦缺血后1 h即有明顯降低（P＜0.05），6 h降至最低。見表1。

表1 各組GABAAR陽性細(xì)胞數(shù)的變化 （個(gè)／視野）

2.2.2 GABAARα1 mRNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較：各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)對照組與正常對照組相比，神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)無明顯改變（P＞0.05），但與正常對照組及假手術(shù)對照組比，腦缺血24 h大腦皮質(zhì)GABAARα1 mRNA的陽性神經(jīng)元數(shù)目減少，3 d降至更低（P＜0.05），見表2。

表2 各組GABAARα1 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)的變化 （個(gè)／視野）

3 討論

腦缺血時(shí)，由于能量合成不足及攝取障礙，導(dǎo)致缺血區(qū)周圍興奮性氨基酸聚集，引起一系列細(xì)胞毒性反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，即興奮性毒性作用［8］，它在腦缺血的病理生理機(jī)制中起重要作用，GABA對腦缺血有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用［9］，GABAAR介導(dǎo)的生物效應(yīng)在腦缺血損傷中發(fā)揮著重大作用。實(shí)驗(yàn)在大鼠腦缺血模型的基礎(chǔ)上，觀察了缺血自然病程中GABAAR及其基因的變化規(guī)律。缺血后不同時(shí)間，GABAAR及受體基因弱陽性神經(jīng)元為缺血損傷重的神經(jīng)元。該研究提示了GABAAR及受體基因參與了腦缺血損傷的不同過程。研究表明，手術(shù)操作不影響受體及其基因的表達(dá)。GABAAR在腦缺血1 h即有所下降，6 h時(shí)更明顯著，這也說明GABAAR隨著缺血時(shí)間的延長，損傷在進(jìn)一步加重。與以前的研究結(jié)果對照，即血液和腦脊液中的GABA在腦缺血損傷中呈先升高后降低的改變，我們可以推測在腦缺血時(shí)，GABAAR數(shù)量的改變可能與腦缺血損傷時(shí)細(xì)胞外液中GABA快速增加，負(fù)反饋抑制腦內(nèi)GABAAR表達(dá)的原因，也可能是由于受體內(nèi)移引起的。另外，有研究證實(shí)，選擇性NMDA受體激動劑或拮抗劑也可調(diào)節(jié)GABAAR功能和亞單位的表達(dá)，因而推測腦缺血時(shí)細(xì)胞外液中高濃度的谷氨酸激動NMDA受體可能也參與GABAAR結(jié)構(gòu)的變化［6］。考慮遲發(fā)性GABAAR含量的減少，與腦損傷時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的壞死有關(guān)。

Kharlamov 等［7］研 究 顯 示，缺 血 性 腦 損 傷 后，GABAARα1基因在缺血后7 d下降明顯，30 d有所恢復(fù)，說明缺血損傷后，其代償機(jī)制具有復(fù)雜的時(shí)間依從性，GABAARα1基因在梗死后下調(diào)，可能由于基因轉(zhuǎn)錄水平下降或者是基因穩(wěn)定性下降導(dǎo)致。我們的研究結(jié)果是：腦缺血24 h時(shí)，GABAARα1基因含量即開始下調(diào)，3d時(shí)明顯降低，推測，GABAARα1基因含量的變化與缺血后腦損傷有一定關(guān)系。與以往的研究結(jié)論相比，受體基因含量降低的時(shí)間段不同，推測可能與所采用的研究方法以及模型的制作不同相關(guān)。我們的試驗(yàn)在缺血大鼠模型基礎(chǔ)上，運(yùn)用了先進(jìn)的原位雜交技術(shù)，進(jìn)一步證明了腦缺血后腦組織中GABAARα1基因含量的下降，提示了缺血損傷后GABAARα1基因轉(zhuǎn)錄受阻或其穩(wěn)定性下降。

從以上研究結(jié)果來看，GABAAR及其受體基因在腦缺血過程中具有保護(hù)作用，因此，對其進(jìn)行進(jìn)一步研究有助于缺血性腦血管病的治療，渴望成為缺血性腦血管病治療的新突破。

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