仿刺參育苗期爛邊病及抗生素選擇分析

蘇美燕

(萊陽慧農養殖服務有限公司 山東 萊陽 265200)

0 引言

仿刺參（Apostichopus japonicus）又稱灰刺參、刺參，是海參中質量最好的一種，被譽為“參中之冠”，主要分布于我國的遼寧、山東和河北沿海，主產于煙臺、威海、長山島、大連等地。自20 世紀50 年代以來國內逐漸開展了刺參人工育苗及增養殖技術研究工作，相繼開展了刺參人工育苗生產，生產規模不斷擴大，現在每年生產的刺參商品苗已突破億枚，甚至高達數十億枚，居世界首位。

同時，刺參養殖業的迅猛發展和不規范運作也造成了病害問題日趨突出，出現了多種明顯病癥和大規模死亡現象，部分養殖區相繼發生了很多疾病。 苗種培育的成敗是決定仿刺參養殖產量的重要因素。有關海參疾病的研究,國內外報道多屬疾病的調查范疇。 本文對刺參育苗期爛邊病及其致病源進行分析，以期為刺參病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

患病耳狀幼體取自山東蓬萊某發病仿刺參育苗池，經鏡檢有明顯的爛邊癥狀，體長650－700μm。 以虹吸法抽取適量發病育苗池池水至消毒塑料瓶，水中含患病幼體約1 萬只，充氣，人工感染用健康幼體采自山東蓬萊一仿刺參育苗場，體長650μm－700μm。

1.1.2 培養基及試劑

細菌分離用培養基TSA 和TCBS 均購自北京陸橋技術有限責任公司；ID32E 細菌鑒定系統試驗條購自生物梅里埃中國有限公司；抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 病參的顯微鏡檢

以無菌燒杯取發病池水，靜置5min，吸取燒杯底部池水置顯微鏡下觀察，選取其中典型的爛邊耳狀幼體，制作水浸片逐一鏡檢，初步觀察記錄幼體病變情況。

1.3 病原的分離純化

以300 目無菌篩絹過濾池水得到患病幼體， 用無菌海水充分洗滌，并收集于Eppendorf 管，將患病幼體離心(2800×g，5min)富集后，以無菌研缽充分研磨。在無菌條件下，用接種環挑取研磨后得到的樣品，在TSA 和TCBS 固體培養基上劃線分離；將平板置于28℃恒溫生化培養箱培養，38h 后挑取優勢菌落，連續進行4 次純化培養得到優勢菌。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態觀察純培養的細菌于28℃培養24h 后，進行革蘭氏染色和光鏡觀察。

1.5 人工回接感染

1.5.1 菌懸液的制備

用接種環將分離所得優勢菌接種于液體培養基中放在培養箱（28℃160-180r/min）中振蕩培養24h，取出離心(4000×g，5min)得到菌泥，用1.5%的滅菌生理鹽水將所得優勢菌制成懸液，并用麥式比濁法確定濃度。

1.5.2 浸浴法人工回接感染

將12 個2L 的燒杯置于盛有20L 自來水的塑料水箱（底部設置加熱棒）內，燒杯內底部放置一塊圓形波紋板(面積同燒杯的底面，緊貼燒杯內壁)，注入無菌海水1L，調節整個系統溫度于19－22℃。 在各燒杯內投放健康耳狀幼體，使其終密度為1.1cells/mL。 各感染組燒杯中加入菌懸液， 使細菌終濃度分別為1.0×104cells/mL、1.0×105cells/mL、1.0×106cells/mL、1.0×107cells/mL 和1.0×108cells/mL，空白對照組不加細菌。 各感染組和對照組均設2 個平行。 實驗期間投喂新月菱形藻和紅酵母，投喂量為2.5×104cells/mL;每天換水1 次，換水量為1/2(感染組需補充細菌，維持感染濃度);整個實驗光強控制在1300lx 左右。 每隔5h鏡檢幼體情況， 并從感染后出現癥狀的幼體中再次分離優勢細菌，進行形態及生理生化指標分析（方法同前）。

1.6 藥敏試驗

選用生產中常用藥物，采用紙片法進行藥敏測試；用麥式比濁法配制濃度大于1×109cells/mL 的菌懸液約1mL， 吸取100μL 均勻涂布于TSB 培養基上，貼上藥敏試紙，于28℃培養箱恒溫培養24h，觀察有無抑菌圈產生，判斷藥物敏感性。

2 結果與分析

2.1 患病幼體癥狀觀察、病原初檢和優勢菌分離

經鏡檢發現：患“爛邊癥”的耳狀幼體失去浮游能力、活力下降，體表邊緣發黑、粗糙并出現不同程度的潰爛，嚴重者發生解體、自溶。 在患病個體潰爛組織處均發現大量活躍的細菌，未發現寄生蟲、霉菌等其它病原，由此可初步確定細菌是主要病原。 分離得到1 種優勢菌株記為RES-1。 RES-1 在TSA 培養基上的菌落為圓形,邊緣光滑,濕潤不透明,呈微黃。 并在TCBS 培養基上生長良好且使培養基變成黃色。

2.2 細菌學鑒定結果

細菌RES-1(從病參分離)、RES-2(從人工感染病參分離)均呈革蘭氏陰性，短桿狀略有彎曲。

2.3 人工回接感染結果

優勢菌RES-1 對健康仿刺參幼體的浸浴感染實驗結果見表1。 5個感染組均出現“爛邊”癥狀，出現時間分別為實驗開始后的第30、25、20、10 和5h。觀察比較25h 和50h 內刺參狀況發現：隨著感染時間的延長，各感染組燒杯水層中健康幼體逐漸減少并開始下沉，而燒杯底部幼體檢出數逐漸增多(除了1.0×108和1.0×107感染組因細菌劑量高幼體已發生解體、 自溶， 故50h 時燒杯底部上的幼體檢出數少于25h 時)。 通過鏡檢發現各感染組幼體均出現規律性的病變:感染初期幼體活力下降，浮游能力降低，繼而體表外周明顯加厚、顏色發黑;有的幼體胃部發黑萎縮，停止攝食，體壁腫大并崩解;隨著感染時間的推移，幼體發生溶解并最終解體、死亡；而對照組幼體未發生爛邊癥狀。從出現“爛邊”癥狀的幼體中再次分離病原，得到優勢菌RES-2，對其進行形態學及生理生化分析，結果與RES-1 完全一致，結果符合科赫法則。

2.4 藥敏實驗結果

菌株RES-1 對生產中常用的抗菌藥物的敏感性檢測見表2。 菌RES-1 對少數抗生素，包括鏈霉素、四環素、利福平、青霉素G、強力霉素不敏感，對其它受試抗菌藥物較敏感。

3 討論

目前，中國仿刺參養殖技術從人工育苗到成參的養殖和人工增殖均處于世界領先水平，仿刺參養殖經濟效益高，市場發展空間巨大，已成為我國北方海水養殖的支柱產業。 隨著海參業的迅猛發展，出現了技術落后和病害等一系列問題，長期以來有關仿刺參的研究主要集中在繁殖生物學、育苗技術、養殖生態以及藥用活性物質等，對近幾年來養殖及育苗中出現的各種病害只有簡單外在的描述，并未進行較深入系統的研究。 中國仿刺參養殖主要集中在山東和遼寧沿海地區，也是海參各種疾病流行較廣泛的地區，包括腐皮綜合征、爛邊癥、爛胃病、化板癥、細菌性潰爛病、盾纖毛蟲病、霉菌病、扁形動物病和后口蟲病等，嚴重制約著水產養殖業的發展。而近幾年在遼寧、山東等地仿刺參浮游期幼體時期較廣泛流行的疾病是“爛邊癥”。 該病具有流行性廣、死亡率高等特性。王印庚等首先對浮游期幼體的“爛邊癥”進行了病原學研究。 發現該病是有弧菌屬細菌引起，該菌是危害水產養殖動物的重要病原之一，也是引發海參疾病的主要病原。山東長島、膠南等地育苗場均有該病發生，死亡率達70%以上，可見其危害相當嚴重，鑒于此本文對該爛邊癥的病原及其致病來源作了再次的分析。通過培養基培養分離出優勢菌株，將分離的優勢菌株進行人工回接感染，結果符合科赫法則，因此最終確定了“爛邊癥”的病原。進一步從形態學、生理生化方面對病原進行分析，將其鑒定為弧菌屬燦爛弧菌。在本研究中，對水產生產中常用的抗生素進行了敏感性檢測，結果發現病原菌對一些抗生素具有抗藥性，而對大多數受試藥物敏感，這些藥物均可考慮在生產中用于該病的防治。因此，在本研究的基礎上，我們建議在養殖生產中，為了避免爛邊癥的發生，一方面，應杜絕病原菌進入養殖系統，進一步嚴格進行餌料質量檢測和凈化育苗水體，包括水源水、親參育苗系統等;另一方面，在進行藥物防治時，藥物選擇必須對病原有針對性，切忌濫用抗生素。

表2 菌株RES-1 的藥敏實驗結果