啤酒花潛隱類病毒研究進展

郭立新，徐 穎，蔡曹盛

（北侖出入境檢驗檢疫局，浙江 寧波 315800）

啤酒花（Humulus lupulus）又稱酒花、蛇麻花、酵母花等，屬桑科多年生蔓性草本植物，是制造啤酒的關鍵原料[1]。目前，世界上已報道的啤酒花類病毒有3種，即：啤酒花潛隱類病毒（Hop latent viroid，HpLVd）、啤酒花矮化類病毒（Hop stunt viroid，HpSVd）和蘋果皺果類病毒（Apple fruit crinkle viroid，AFCVd）[2]，其中啤酒花潛隱類病毒是發生最普遍的一種潛隱類病毒。

1 分布與危害

啤酒花潛隱類病毒隸屬于Cocadviroid屬，分布于英國[3-5]、德國[6]、韓國[7]、波蘭[8]、日本[9]、捷克[10]、巴西[11]、美國[2]、中國新疆[12]等國家和地區的啤酒花上。該類病毒侵染啤酒花后不表現明顯的癥狀，但感染Omega品種后出現萎黃、生長緩慢等現象[3,13~14]。當啤酒花受該類病毒侵染后，一些次生代謝產物成分發生改變，從而影響啤酒花品質，降低啤酒花產量。Adams等[4]報道，不同啤酒花品種受HpLVd侵染后，a-酸的含量降低20%～50%；受HpLVd侵染的啤酒花球果產量降低11%[3]。

2 生物學特性

啤酒花潛隱類病毒寄主范圍較窄，僅侵染啤酒花（Humulus lupulus）、葎草（Humulus japonicus）和異株蕁麻（Urtica dioica）[2,6]。且該類病毒在啤酒花不同組織中含量有差異，同一植株球果中含量最高，其次是葉片，再次是種子，花粉中含量最少[13,15]。HpLVd沒有草本寄主植物，黃瓜、西紅柿、菊花（Chrysanthemum）、冬瓜（Benincasa hispida）、紫鵝絨（Gynura aurantiaca）和心葉煙（Nicotiana glutinosa）均不能被啤酒花潛隱類病毒侵染[13]。

HpLVd主要通過無性繁殖材料、農事操作工具進行傳播；也可通過種子（8%傳毒率）、花粉傳播，但傳毒率很低；至今尚無昆蟲介體傳播的報道[4,13,15]。一旦園中啤酒花感染了HpLVd，其傳播速度很快，但其侵染率也因啤酒花品種而異[2]。在捷克種植Osvald’s clone 72品種的啤酒花園植株3 a內感染率從零星侵染增至65%[15]；在英國種植cv.Omega品種的啤酒花園植株2 a內受侵染率從個別感病增至75%，而種植cv.Wye Northdown品種的園中啤酒花受侵染卻較少[4]。HpLVd在啤酒花體內的含量還與種植地區和季節等有很大關系[2]。在英國春末啤酒花中HpLVd含量較高[16]；在德國，夏季HpLVd含量相對有所下降[6]。

3 基因組結構與序列分析

啤酒花潛隱類病毒的基因組為一條環狀單鏈RNA，長 256 nt，具有 5 個功能區，即：左手區（TL）、致病區（P）、中央保守區（C）、可變區（V）和右手末端區（TR），形成穩定的桿狀二級結構。通過不對稱滾環模式進行復制，基因組不編碼蛋白質[13,17]。

目前，已報道啤酒花潛隱類病毒24個分離物核苷酸的全序列，這些序列之間高度同源，同源性達97.3%～100%。Matoussek等[18]研究表明，受 HpLVd侵染的啤酒花在正常栽培條件下生長，啤酒花潛隱類病毒基因序列不易發生變異，但環境改變可加劇啤酒花潛隱類病毒核苷酸變異，將受HpLVd侵染的啤酒花植株進行熱處理，雖然導致了類病毒濃度降低，卻增加了很強的序列變異。

4 檢測方法

由于啤酒花潛隱類病毒不編碼任何蛋白，因此不能利用免疫學（血清學），如酶聯免疫吸附（ELISA）的方法來檢測；又因HpLVd至今尚無指示植物，故不能通過生物學方法來檢測。迄今為止，國內外檢測啤酒花潛隱類病毒的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳法[9,13]、核酸雜交法[9,15]和基于RT-PCR的分子生物學檢測方法[2,9,12,15,19]。

4.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是一種基于類病毒RNA分子的特殊環狀結構進行檢測的方法。該方法檢測啤酒花潛隱類病毒常用的有兩種，即：二維電泳和往返雙向電泳[20-21]。

4.1.1 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳法 二維電泳（2-Dimensional-PAGE）一次只能對一個樣品進行檢測[20]。Hataya T等利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳對啤酒花品種VF-cv.Kirin II進行試驗，結果顯示檢測到類病毒條帶[9]。

4.1.2 往返雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法 往返雙向電泳（Return-PAGE）方法一次可對多個樣品進行檢測[21]。Holger P等對8個不同品種的啤酒花樣品和2個接種HpSVd的西紅柿樣品進行往返雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗發現，其中有2個品種的啤酒花樣品未檢測到類病毒條帶，另外6個品種的啤酒花樣品均檢測到不同于HpSVd的環狀RNA條帶[13]。

二維電泳與往返雙向電泳能檢測出一種病原物是否為類病毒，且該方法是唯一一種不需要知道類病毒核酸序列就可以進行檢測的方法。

4.2 核酸雜交法

核酸雜交方法（Molecular hybridization）是一種分子生物學的標準技術，用于檢測DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）[22]。啤酒花潛隱類病毒的核酸雜交法有：斑點雜交（Dot blot hybridization）、Northern印跡雜交（Northern blot hybridization）等方法。

4.2.1 斑點雜交法 目前cRNA探針和cDNA探針及合成的寡核甘酸探針已被應用于類病毒的檢測[22]。Hataya T等應用HpLVd cDNA探針對日本采集的啤酒花樣品進行斑點雜交試驗發現，日本啤酒花已受到HpLVd的侵染[9]。Matousek J[23]通過斑點雜交試驗檢測接種熱突變HpLVd的西紅柿不同組織中啤酒花潛隱類病毒的含量，結果顯示，頂部葉片中HpLVd含量最高。Liu S等[12]應用生物素標記的HpLVd cDNA探針對新疆采集的啤酒花樣品進行了斑點雜交檢測，發現各個采集地的啤酒花均受到了HpLVd的侵染。斑點雜交方法檢測啤酒花潛隱類病毒具有準確、特異性好、靈敏度高的特點，適合于大批量樣品檢測。

4.2.2 Northern印跡雜交 Northern印跡雜交是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。Holger P等[13]應用Northern印跡雜交技術對啤酒花樣品進行試驗發現，在55℃條件下放射性HpLVd cRNA探針能與樣品中的啤酒花潛隱類病毒核酸成功雜交，而75℃條件下雜交卻失敗，而放射性HpSVd cRNA探針在55℃和75℃時均能成功雜交。捷克學者Jaroslav M等[24]利用Northern印跡雜交技術對啤酒花花粉進行了HpLVd的成功檢測。

核酸雜交靈敏度較高，忠實性強，一次可對大量樣品進行檢測，但需要有特異性探針。非放射性探針的使用克服了放射性探針存在的如半衰期、安全性、放射性廢棄物處理和操作不便等固有的缺陷。用靈敏的熒光底物代替顯色底物，尼龍膜代替硝酸纖維素膜，可以提高非放射性檢測的靈敏度。使用cRNA探針的信號/背景比cDNA探針要好，說明cRNA探針有較高的靈敏度[25-27]。

4.3 基于RT-PCR的分子生物學檢測法

目前，檢測與鑒定啤酒花潛隱類病毒基于RTPCR的分子生物學技術主要包括逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、二重 RT-PCR（multiplex RT-PCR）和實時熒光RT-PCR技術。

4.3.1 逆轉錄-聚合酶鏈式反應 逆轉錄-聚合酶鏈式反應已廣泛用于啤酒花類病毒的檢測。國外，Hataya T等應用RT-PCR法和斑點雜交法同時對日本采集的啤酒花樣品進行檢測，試驗結果顯示，RT-PCR方法比斑點雜交方法更加靈敏[9]。Matousek等[15]設計了一對特異性引物，研究建立了啤酒花潛隱類病毒的RT-PCR檢測方法，并應用該方法對啤酒花種子及雜交苗等進行了成功檢測。我國Liu等[12]對新疆7個不同地區采集的16份啤酒花樣品進行了HpLVd的成功檢測。該方法檢測靈敏度高，專一性強。

4.3.2 二重RT-PCR 二重RT-PCR基本原理與常規RT-PCR相同，區別是在同一個反應體系中加入兩對引物，同時在同一反應體系中擴增出一條以上的目的DNA片段[28]。Eastwell K C等[2]應用二重RT-PCR方法對美國華盛頓采集的啤酒花樣品進行了HpLVd和HpSVd的同時檢測，擴增到大小為256 bp和300 bp的兩條目的條帶。此方法相對于單重RT-PCR而言，更加經濟、快速，但對引物的設計要求嚴格。

4.3.3 實時熒光RT-PCR檢測方法 利用TaqMan探針進行實時熒光RT-PCR反應是在常規RTPCR反應體系中添加1條TaqMan探針，從而使熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步[29－30]。郭立新等[19]根據HpLVd的保守基因序列，設計了引物和TaqMan-MGB探針，并利用該引物和探針對新疆采集的啤酒花樣品進行了啤酒花潛隱類病毒的成功檢測。

迄今為止啤酒花潛隱類病毒的檢測方法已從聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法過渡到核酸雜交方法，再進一步發展為RT-PCR等方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法費時、費力、靈敏度較低，且不能明確知道是哪種類病毒。核酸雜交法的前提是要制備探針，較為復雜，且檢測步驟繁瑣。RT-PCR及二重RT-PCR技術雖然簡單易行，但需進行PCR后處理，易發生交叉污染，造成假陽性現象。實時熒光檢測方法利用熒光探針實時監測目的基因的擴增，實現RT-PCR擴增與探針檢測同時進行，整個檢測過程完全閉管，不需PCR后處理，是檢測HpLVd最靈敏、準確與快速的方法。

5 防治與控制

由于啤酒花主要通過根插或根（狀）莖進行無性繁殖[2]，且HpLVd侵染植株不表現明顯癥狀，故感染了啤酒花潛隱類病毒的母本植株僅憑肉眼觀察癥狀、未經分析檢測作為繁殖材料，造成了該類病毒在世界各地廣泛傳播[13]。目前一些學者已進行了脫毒研究，并發現分生組織培養[9]、溫熱療法[31]及冷處理[16]能有效降低啤酒花中HpLVd含量。Hataya T等[9]對受HpLVd侵染的啤酒花進行分生組織培養，獲得2個無類病毒的無性繁殖材料。Matousek J等研究表明，熱處理能降低啤酒花中HpLVd含量，將啤酒花保持35℃培養2周，其體內HpLVd含量下降70%～90%[18,31]。ADAMS A N等[32]將侵染HpLVd的啤酒花在黑暗條件下保持2~4℃培養幾個月后再進行分生組織培養，可獲得無HpLVd的植株。啤酒花潛隱類病毒可通過農事操作工具進行傳播，在農事操作時應使用化學藥劑對工具、機械進行消毒，盡可能防止交叉感染[15]。

6 結束語

筆者較為系統地綜述了啤酒花潛隱類病毒的分布與危害、生物學特性、基因組結構與序列分析、檢測方法及預防與控制等方面的研究進展。明確了HpLVd是一種流行范圍廣、難以防治、對啤酒花生產造成一定經濟損失的潛隱類病毒。清楚了解了其基因組及核苷酸序列之間的同源性。同時，本文還分析了當前檢測HpLVd的聚丙烯酰胺凝膠電泳法、核酸雜交法、逆轉錄-聚合酶鏈式反應、二重RT-PCR和實時熒光RT-PCR技術等各種檢測方法的優缺點，并認為實時熒光RT-PCR技術效果最好。最后，概述了防治與控制啤酒花潛隱類病毒的關鍵是對母本植株進行嚴格檢疫，使用無毒繁殖材料。農事操作時使用化學藥劑對工具、機械進行消毒，盡可能防止交叉感染。

[1]臧廣鵬，張梅秀，楊振華，等.啤酒花脫毒組培苗培育技術[J].甘肅農業科技，2010，3：59-60.

[2]Eastwell K C,Nelson M E.Occurrence of viroids in commercial hop （Humulus lupulus L.）production areas of Washington State[Z].Online.Plant Health Progress doi:10.1094/PHP-2007-1127-01-RS.

[3]Adams A N,Barbara D J,Morton A.Effects of hop latent viroid on weight and quality of the cones of the hop cultivar Wye Challenger[J].Annals of Applied Biology,1991,118 （Suppl）:126-127.

[4]Adams A N,Morton A,Barbara D J,et al.The distribution and spread of hop latent viroid within two commercial plantings of hop（Humulus lupulus）[J].Annals of Applied Biology,1992,121（3）:585-592.

[5]Barbara D J,Morton A,Adams A N.Assessment of UK hops for the occurrence of hop latent and hop stunt viroids[J].Annals of Applied Biology,1990,116（2）:265-272.

[6]Knabel V S,Seigner L,Wallnofer P R.Detection of hop latent viroid （HLVd）using the polymerase chain reaction（PCR）[J].Gesunde Pflanzen,1999,51（7）:234-239.

[7]Lee J Y,Lee S H,Sanger H L.Viroid diseases occurring on Korean hop plants[J].Korean Journal of Plant Pathology,1990,6（2）:256-260.

[8]Solarksa E,Skomra U,Kitlinksa J,et al.The occurrence of hop latent viroid（HLVd）in hop plants in Poland[J].Phytopathology Polonica,1995,10:55-59.

[9]Hataya T,Hikage K,Suda N,et al.Detection of hop latent viroid（HLVd）using reverse transcription and polymerase chain reaction（RT-PCR）[J].Annals of the Phytopathologicial Society of Japan,1992,58（5）:677-684.

[10]Matousek J,Trnena L,Ruzkova P,et al.Analysis of hop latent viroid （HLVd）in commercial hop clones in Czech Republic[J].Rostlinna Vyroba,1994,40（10）:973-983.

[11]Fonseca M E N,Marinho V L A,Nagata T.Hop latent viroid in hop germ plasm introduced into Brazil from the United States[J].Plant Disease,1993,77（9）:952.

[12]Liu S,Li S,Zhu J,et al.First report of Hop latent viroid（HLVd）in China[J].Plant Pathology,2008（2）,57:400.

[13]Holger P,Karla R,Heinz L S.The molecular structure of hop latent viroid（HLV）,a new viroid occurring worldwide in hops[J].Nucleic Acids Research,1988,16（10）:4197-4216.

[14]Barbara D J,Morton A,Adams A N,et al.Some effects of hop latent viroid on two cultivars of hop（Humulus lupulus）in the UK[J].Annals of Applied Biology,1990,117（2）:359-366.

[15]Matousek J,Patzak J.A low transmissibility of hop latent viroid through a generative phase of Humulus lupulus L[J].Biologia Plantarum,2000,43（1）:145-148.

[16]Morton A,Barbara D J,Adams A N.The distribution of hop latent viroid within plants of Humulus lupulus and attempts to obtain viroid-free plants[J].Annals of Applied Biology,1993,123（1）:47-53.

[17]Fauquet C M,Mayo M A,Maniloff J,et al.Virus taxonomy:Classification and Nomenclature of Viruses,Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses[M].San Diego,CA,USA:Acadenic Press,2005.1147-1156.

[18]Matousek J,Patzak J,Orctová L,et al.The variability of hop latent viroid as induced upon heat treatment[J].Virology,2001,287:349-358.

[19]郭立新，段維軍，張祥林，等.實時熒光RT-PCR檢測啤酒花潛隱類病毒[J].植物病理學報，已收錄.

[20]Hataya T.Recent research in viroid diseases and diagnosis[J].Research in virology,1999,1:789-815.

[21]Schumacher J,Randles J W,Riesner D.A two-dimensional electrophoresis technique for the detection circular viroids and virusoids[J].Analytical Biochemistry,1983,135（2）:288-295.

[22]李桂芬，李明福，張永江.植物類病毒檢測技術概述[J].河南農業科學，2007，3：19-21.

[23]Matousek J.Hop latent viroid（HLVd）microevolution:an experimental transmission of HLVd “thermomutants”to solanaceous species[J].Biologia plantarum,2003,46（4）:607-610.

[24]Jaroslav M,Lidmila O,Josef S,et al.Elimination of hop latent viroid upon developmental activation of pollen nucleases[J].Biological chemistry,2008,389（7）:905-918.

[25]Candresse T,Macquaire G,Brault V,et al.32P-and biotin-labelled in vitro transcribed cRNA probes for the detection of potato spindle tuber viroid and Chrysanthemum stunt viroid[J].Research in Virology,1990,141（l）:97-107.

[26]Nakahara K,Hataya T,Hayashi Y,et al.A mixture of synthetic oligonucleotide probes labeled with biotin for the sensitive detection of potato spindle tuber viroid[J].Journal of virological methods,1998,71（2）:219-227.

[27]Lakshman D K,Hiruki C,Wu X N,et al.Use of 32P RNA probes for the dot-hybridization detection of Potato spindle tuber viroid[J].Journal of virological methods,1986,14（3-4）:309-319.

[28]黃留玉.PCR最新技術原理、方法及應用[M].北京：化學工業出版社，2005.

[29]Heid C A,Stevens J,Livak K J.Real time quantitative PCR[J].Genome Research,1996,6:986-994.

[30]Salmon M A,Vendrame M,Kummert J,et al.Rapid and homogenous detection of Apple stem pitting virus by RT-PCR and a fluorogenic 3’minor groove binder-DNA probe[J].European Journal of Plant Pathology,2002,108:755-762.

[31]Matousek J,Trnena L,Svoboda P,et al.The gradual reduction of viroid levels in hop mericlones following heat therapy:a possible role for a nuclease degrading dsRNA[J].Biological Chemistry HoppeSeyler,1995,376（12）:715-721.

[32]Adams A N,Barbara D J,Morton A,et al.The experimental transmission of hop latent viroid and its elimination by low temperature treatment and meristem culture[J].Annals of Applied Biology,1996,128（1）:37-44.