microRNA和T細胞發育研究進展

鐘國成，李小紅 綜述，朱 波校審

（第三軍醫大學新橋醫院全軍腫瘤研究所，重慶 400037）

隨著現代免疫學向分子水平的研究不斷深入，T淋巴細胞（T－lymphocyte，簡稱T細胞）在免疫系統中發揮的作用也越來越受到重視。T細胞是淋巴細胞的主要組分，在抗感染、抗腫瘤及自身免疫應答中均發揮著關鍵作用。T細胞的發育成熟是一個反復篩選與淘汰的復雜過程，受到多種因素的精細調控。近年來，微RNA（microRNA，miRNA）的功能和作用正逐漸成為學者們關注的重點。借助對miRNA基因水平的研究，將有力地促進闡明T細胞發育的調控機制［1］。本文就miRNA調控T細胞發育的相關研究進展做一綜述，并探討miRNA對T細胞發育調控的特點和應用前景。

1 T細胞發育概述

T細胞源于骨髓造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）。HSCs首先分化為多能祖細胞，然后經淋巴途徑向淋巴祖細胞分化。淋巴祖細胞中T細胞祖細胞（Pro－T）經血循環進入胸腺發育成T細胞前體細胞（Pre－T），隨后發育成胸腺細胞。胸腺是T細胞主要的發育器官，摘除胸腺將導致嚴重的免疫缺陷。T細胞發育的胸腺依賴性提示胸腺為T細胞提供了適宜的微環境和發育信號［2］。

胸腺細胞始于CD4－CD8－雙陰性T細胞（double negative，DN），此時細胞表面已表達CD3和T細胞受體（T cell receptor，TCR），然后經CD4＋CD8＋雙陽性細胞（double positive，DP）發育為成熟的 CD4＋或 CD8＋單陽性（single－positive，SP）細胞。發育過程中不能與自身主要組織細胞相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）結石的T細胞將被誘導凋亡，即陽性選擇，它賦予T細胞MHC限制性（識別由自身MHC呈遞的抗原而不識別其他MHC呈遞的抗原）；而與自身MHC或自身抗原結合過強的T細胞也會被誘導凋亡，即陰性選擇，它賦予T細胞對自身抗原的耐受性［3］。胸腺每天能產生約1×107個胸腺細胞，最終僅有1%～3%的胸腺細胞能發育成SP細胞。

由此可見，T細胞發育是一個十分復雜的過程，需要一個龐大的調控網絡參與，以確保成熟T細胞在數量上保持動態平衡，同時正確執行免疫功能，不會忽視抗原或是攻擊自身組織，維持適宜的免疫強度。miRNA是調控T細胞發育的一個重要因素，其調控作用已引起了研究者的濃厚興趣。

2 miRNA概述

miRNA是一組進化保守的調控性小分子RNA，無編碼蛋白質作用，能通過干擾靶向信使RNA（messenger RNA，mRNA）的穩定或翻譯而調節基因表達。miRNA先由RNA聚合酶Ⅱ轉錄成含帽子結構和多聚腺苷酸尾巴的初始RNA（primiRNA）。pri－miRNA經胞核內 RNA聚合酶Ⅲ（RNaseⅢ）Drosha在雙鏈RNA－結合蛋白DGCR8／Paha的作用下加工成長約70核苷酸（nt）的pre－miRNA。轉運蛋白Exportin5依賴Ran－GTP將pre－miRNA從細胞核轉運至細胞質，RNaseⅢ酶Dicer將pre－miRNA剪切成約22nt的雙鏈miRNA。兩條鏈迅速解螺旋，其中一條很快降解，而另一條鏈作為成熟miRNA形成RNA誘導沉默復合物（RNA－induced silencing complex，RISC）而發揮調節作用。當miRNA與靶向mRNA的3′UTR完全互補時，RISC中的Argonaute2會降解mRNA而起到調節作用；如果部分互補將通過抑制mRNA翻譯來發揮調節功能［4］。

近年來，通過基因芯片和深度測序技術對T細胞成熟過程中不同階段miRNA的鑒定表明:確實有部分miRNA在T細胞發育過程中出現顯著的變化，這種特定miRNA豐度的動態變化可以作為界定各個發育階段的特異性指標。

3 miRNA對T細胞發育過程的調控

miRNA對T細胞發育的調控可大致分為胸腺內調控和胸腺外調控，其中前者是主要調控場所，是調控的上游，決定T細胞發育的命運。在胸腺內，參與T細胞發育調控的miRNA構成了一個復雜的調控網絡，彼此調節與制約，與胸腺內環境形成緊密聯系，在適當的時間精確控制T細胞的發育過程。miRNA在胸腺內的調控將參與產生SP細胞的數目，T細胞的MHC限制性、自身抗原耐受性、對抗原的親和力、存活時間以及增殖和應答潛能；而miRNA在胸腺外的調控相對于胸腺內簡單，影響因素較少，可視為對胸腺內調控的補充或細化，主要參與調控外周T細胞的增殖、分化方向以及執行免疫功能的強弱。

3.1 Dicer酶 Dicer酶是一種類似RNaseⅢ的生成關鍵酶，它對于小分子干擾RNA和miRNA的產生是不可或缺的，Dicer酶能將miRNA前體（發夾RNA）加工為成熟的miRNA。缺乏Dicer酶將導致miRNA銳減（包括miRNA－150、miRNA－21、miRNA－103、miRNA－29、miRNA－155等）。研究發現 T 細胞特異性Dicer酶的缺乏會顯著減少T細胞數量，盡管CD4＋與CD8＋T細胞的比例變化不大；Muljo等［5］發現，在小鼠的胸腺組織中去掉Dicer酶，將導致外周血T細胞發育嚴重障礙，細胞內miRNA加工缺陷，面對抗原的刺激難以正常增殖，而且會迅速凋亡。缺乏Dicer酶的Th細胞會偏向分泌IFN－γ，傾向Th1方向分化，這提示Dicer對于抑制Th1細胞的分化是必需的。Dicer酶能夠有效誘導Foxp3（forkhead box P3）轉錄因子的生成，對于胸腺中調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）的發育具有重要作用。缺乏Dicer酶將因為無法正常產生Foxp3而抑制轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）－β介導的Treg的產生，喪失抑制性調控功能，促使Treg高表達效應性T細胞的表面分子，最終誘發致死性的自身免疫［6］。在這個過程中，具體有哪些miRNA參與的機制還不清楚，但可以明確miRNA－155和miRNA－27b在其中發揮了主要作用。此外，缺乏Dicer酶還會導致Th17（一種不同于Th1、Th2和Treg的CD4＋亞群細胞，主要分泌IL－17，參與自身免疫性腦脊髓炎的發生）無法誘導產生［7］。

3.2 miRNA－17～92簇 miRNA－17～92簇由一組多順反子性miRNA組成，位于人類染色體13q31，包括 miRNA－17，miRNA－18a、miRNA－19a、miRNA－20a、miRNA－196－1和 miRNA－92這6個miRNA，在組織結構中高度保守。miRNA－17～92已被證實在腫瘤發生中發揮重要作用。在淋巴細胞系中，miRNA－17～92于前體T細胞高表達，成熟之后表達減少。實驗發現，miRNA－17～92轉基因小鼠外周幾乎所有的淋巴細胞亞群都有擴增，其中以CD4＋T細胞增生最為顯著［8］。miRNA－17～92高表達轉基因小鼠的T細胞在體外的增殖和存活能力都明顯提高，敲除miRNA－17～92將導致嚴重的T細胞發育障礙和迅速凋亡。進一步研究發現，miRNA－17～92作用的靶點（負調控）可能是PTEN（一種腫瘤抑制基因）和Bim（促凋亡因子），在miRNA－17～92高表達的T細胞中Bim明顯下調，但是聯合PTEN和Bim還不足以完全模擬miRNA－17～92過表達的實驗模型，因此分析在調控T細胞發育過程中可能有其他不同的靶位參與［9］。另外，miRNA－17～92對CD8T細胞的具體調控機制目前尚不清楚。

3.3 miRNA－142和 miRNA－223 miRNA－142定位于17號染色體中一個和侵襲性B淋巴細胞白血病相關的位點。Ramkissoon等［10］研究發現，miRNA－142在胸腺、脾臟及骨髓中高表達，而在其他組織中表達很低，其調控作用似乎僅限于造血細胞。目前研究認為，miRNA－142對T細胞發育的調控主要發生在SP階段向初始T細胞發育的過程中，而在其他階段未發現有調控作用。過量表達的miRNA－142能顯著改變T細胞的分化發育，促進初始T細胞增殖30%～40%以上，而對B淋巴細胞則無明顯影響［11］。miRNA－223主要表達于骨髓，單核細胞、粒細胞，在T細胞中低表達，它主要參與調控粒細胞的發育，但過表達的miRNA－223也能促進T細胞的發育和增殖［12］。

3.4 miRNA－181a miRNA－181a在調控B淋巴細胞方面發揮重要作用，同時也參與T細胞的發育。研究發現，miRNA－181a在骨髓、胸腺以及富含T細胞的一級淋巴組織中高表達。如果造血干細胞和祖細胞中高表達miRNA－181a，將導致外周CD8＋T細胞的明顯下降。在小鼠移植模型中，高表達的miRNA－181a將導致外周T細胞減少50%以上，其中CD8＋T細胞減少88%，這提示miRNA－181a對T細胞發育發揮重要作用。

Neilson等［13］系統研究了 T 細胞在 DN1、DN2、DN3、DN4、DP、SP等不同發育階段miRNA－181a的表達情況，結果發現miRNA－181a在DN和DP階段表達量最高，而在之后其他階段逐漸下調。miRNA－181a在胸腺細胞DP階段的豐度，是成熟T細胞中的10倍以上。高表達的miRNA－181a能增強TCR的信號轉導，促進DN，DP階段不成熟T細胞與胸腺MHC分子結合，保證陽性選擇和陰性選擇的順利完成。熒光素酶實驗顯示，在DP階段，miRNA－181a能夠抑制一些淋巴細胞成熟過程中參與陽性選擇的基因表達，比如bcl－2、CD69和TCR。Li等［14］發現，在成熟T細胞高表達 miRNA－181a會提高TCR與抗原的親和力，如果抑制未成熟T細胞miRNA－181a的表達將降低T細胞對抗原肽的敏感性，并破壞T細胞陽性選擇和陰性選擇，這與miRNA－181a在DN和DP高表達，而在T細胞成熟過程中下調一致。事實上，miRNA－181a對TCR與抗原的親和力具有重要的調節作用，它能調控多個靶標，主要包括抑制TCR信號通路中在下游起負性調節作用中的酪氨酸蛋白磷酸酯酶（如SHP－2，PTPN22，DUSP5和DUSP6），通過磷酸化作用激活兩個TCR信號通路分子，即淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte－specific tyrosine kinase，LCK）和細胞外信號調控激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）進而增強TCR的信號強度。另一方面，TCR的信號通路能負反饋抑制miRNA－181a的表達，TCR與抗原結合后1h內，miRNA－181a的表達會迅速下調。通過miRNA－181a對胸腺T細胞發育的這種精細調控機制，使成熟初始T細胞的TCR針對不同抗原具有適宜的親和力［15］。

3.5 miRNA－155 miRNA－155具有類似癌基因的特性，與腫瘤發生關系密切，是目前人類淋巴瘤中發現的惟一獨立致癌miRNA，最初被命名為B細胞整合簇。Georgantas等［16］發現，miRNA－155在造血干細胞中有一定的表達，而成熟造血細胞的miRNA－155卻明顯下降，但在一些血液系統惡性腫瘤中高表達。研究證實，miRNA－155高表達能使T細胞在小鼠骨髓內的增殖紊亂，而敲除miRNA－155的CD4＋T細胞雖然在增殖方面沒有明顯變化，但發育的T細胞識別抗原后無法分泌正常的IL－2和IFN－γ，而且容易發生凋亡，嚴重削弱Treg維持自身動態平衡的能力和增殖潛能。FOXP3是Treg發育和功能所必需的轉錄因子，可以直接控制miRNA－155的表達。miRNA－155在Treg中的表達水平要高于其他T細胞亞群，一般認為，miRNA－155對于維持Treg存活、分泌抑制性細胞因子是非常重要的，它通過作用靶點細胞因子信號抑制物1（suppressor of cytokine signalling 1，SOCS1。該通路能通過IL－2、信號轉導、轉尿激活因子5，STAT5信號傳導通路促進細胞增殖）發揮作用［17－18］。

3.6 其他miRNA的調控作用 與miRNA－181a相似，miRNA－350在T細胞發育的DP階段高表達，而在之后的發育過程中急劇下降。miRNA－16在單核細胞、中性粒細胞和CD8＋T、CD4＋T等多數細胞和組織中高表達，推測其在調控細胞周期上具有重要的作用。miRNA－150可能通過作用靶位轉錄因子c－Myb，而參與調控 T細胞發育。另外，miRNA－669c和miRNA－297在CD4＋T細胞階段特異性高表達；miRNA－15b、miRNA－150、miRNA－24和 miRNA－27在 CD8＋T 細胞特異性高表達［19］；而 miRNA－223和 miRNA－146在 Treg高表達［20］，考慮這些miRNA更多地參與T細胞分化的調控，其具體的作用機制尚需要進一步探討。

4 miRNA在對T細胞發育調控的特點和應用前景

miRNA對T細胞發育過程的調控機制非常復雜。每一種miRNA具有多個潛在的作用靶點（如miRNA－17～92可以達到上百種），在適宜的時間發揮不同的作用；同時miRNA還受到其他多種分子的調控和反饋，在完成某一階段的調控任務后會及時停止。T細胞的發育需要多種miRNA在不同時間共同作用，單一miRNA很難與T細胞發育的特定階段嚴格對應，參與調控的miRNA之間并非獨立工作，而是互相影響，既可以發揮疊加作用，也可以彼此拮抗。正是由于這種多元化調控機制，才能實現T細胞發育的精細與準確，保證發育成熟的T細胞不會攻擊自身組織，而是正確識別感染和腫瘤抗原后予以消滅，并在清除抗原后及時控制免疫強度，避免免疫升級而傷害自身組織，最終保持整個免疫系統的穩定和平衡。

T細胞發育過程中獲得的MHC限制性與自身耐受、自身免疫疾病、過敏性疾病、免疫缺陷病以及腫瘤發生密切相關，深入研究miRNA對于T細胞發育的調控并進行干預將為這些疾病的防治提供良好的應用前景，如改變miRNA－181a的表達而調控TCR的親和力，將有助于加強T細胞對自身抗原的耐受，有利于自身免疫病的治療。當前，針對miRNA的研究需要人們了解其確切的信號通路，找到特定miRNA具體作用的上下游靶分子，包括不同組織不同階段的多個靶位，各自的生物學功能并加以證實［21］。此外，鑒于miRNA網絡調控的特點，嘗試有效進行多個miRNA基因操作，并建立進行體內實驗的技術方法也是今后研究的重點。

5 展 望

目前，miRNA的研究還處于理論和基礎水平上，迄今所知miRNA對T細胞發育的調控很可能只是miRNA網絡中的滄海一粟，而miRNA在調控過程中的具體分子作用機制，也有待于進一步探索［22］。這些miRNA的研究將是對T細胞發育調控理論的創新，也將為與T細胞發育有關的臨床疾病提供新的治療方向。

［1］Liston A，Linterman M，Lu LF.MicroRNA in the adaptive immune system，in sickness and in health［J］.J Clin Immunol，2010，30（3）:339－346.

［2］Koelsch U，Schraven B，Simeoni L，et al.SIT and TRIM determine T cell fate in the thymus［J］.J Immunol，2008，181（9）:5930－5939.

［3］Ashton－Rickardt PG.Studying T－cell repertoire selection using fetal thymus organ culture［J］.Methods Mol Biol，2007（380）:171－184.

［4］Anglicheau D，Muthukumar T，Suthanthiran M.MicroRNAs:small RNAs with big effects［J］.Transplantation，2010，90（2）:105－112.

［5］Muljo SA，Ansel KM，Kanellopoulou C，et al.Aberrant T cell differentiation in the absence of Dicer［J］.J Exp Med，2005，202（2）:261－269.

［6］Zhou X，Jeker LT，Fife BT，et al.Selective mRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity［J］.J Exp Med，2008，205（9）:1983－1991.

［7］Liston A，Lu LF，O′Carroll D，et al.Dicer－dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function［J］.J Exp Med，2008，205（9）:1993－2004.

［8］Lu LF，Liston A.MicroRNA in the immune system，microRNA as an immune system［J］.Immunology，2009，127（3）:291－298.

［9］Lykken EA，Li QJ.microRNAs at the regulatory frontier:an investigation into how microRNAs impact the development and effector functions of CD4Tcells［J］.Immunol Res，2011，49（1／3）:87－96.

［10］Ramkissoon SH，Mainwaring LA，Ogasawara Y，et al.Hema－topoietic－specific microRNA expression in human cells［J］.Leuk Res，2006，30（5）:643－647.

［11］Shivdasani RA.MicroRNAs:regulators of gene expression and cell differentiation［J］.Blood，2006，108（12）:3646－3653.

［12］Merkerova M，Vasikova A，Belickova M，et al.MicroRNA expression profiles in umbilical cord blood cell lineages［J］.Stem Cells Dev，2010，19（1）:17－26.

［13］Neilson JR，Zheng GX，Burge CB，et al.Dynamic regulation of miRNA expression in ordered stages of cellular development［J］.Genes Dev，2007，21（5）:578－589.

［14］Li QJ，Chau J，Ebert PJ，et al.miR－181ais an intrinsic modulator of T cell sensitivity and selection［J］.Cell，2007，129（1）:147－161.

［15］Tsitsiou E，Lindsay MA.microRNAs and the immune response［J］.Curr Opin Pharmacol，2009，9（4）:514－520.

［16］Georgantas RW，Hildreth R，Morisot S，et al.CD34＋hematopoietic stem－progenitor cell microRNA expression and function:a circuit diagram of differentiation control［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（8）:2750－2755.

［17］Rodriguez A，Vigorito E，Clare S，et al.Requirement of bic／microRNA－155for normal immune function［J］.Science，2007，316（5824）:608－611.

［18］O′Connell RM，Kahn D，Gibson WS，et al.microRNA－155promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development［J］.Immunity，2010，33（4）:607－619.

［19］Merkerova M，Belickova M，Bruchova H.Differential expression of microRNAs in hematopoietic cell lineages［J］.Eur J Haematol，2008，81（4）:304－310.

［20］Cobb BS，Hertweck A，Smith J，et al.A role for Dicer in immune regulation［J］.J Exp Med，2006，203（11）:2519－2527.

［21］Pauley KM，Chan EK.MicroRNAs and their emerging roles in immunology［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，1143（1）:226－239.

［22］Baltimore D，Boldin MP，O′Connell RM，et al.MicroRNAs:new regulators of immune cell development and function［J］.Nat Immunol，2008，9（8）:839－845.