哺乳動物卵巢生殖干細胞研究的現狀與未來

李朝暉, 郭 琨, 鄭 萍

(中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室, 云南 昆明 650223)

無脊椎動物(如果蠅)和低等脊椎動物(如鳥類和魚類)的卵巢內存在卵巢生殖干細胞, 生殖干細胞可以持續進行自我更新和分化從而形成新的卵細胞, 這個現象稱為卵細胞的從頭發生或再生(neo-oogenesis) (Pearl, 1917; Draper et al, 2007;Kirilly & Xie，2007)。雄性哺乳動物也存在精原干細胞維持精子的持續發生。但雌性哺乳動物卵巢內是否存在生殖干細胞及雌性配子的再生卻備受爭議(Vermande-Van Eck, 1956; Gosden, 1975; Gosden,2004; Telfer, 2004)。雖然一個世紀前就存在反對和支持的觀點, 但由于未能獲得充分的證據支持哺乳動物雌性配子的再生, 1951年美國科學家Zuckerman發表了一篇總結性論文, 指出哺乳動物雌性配子的發生僅出現于胚胎發育期, 哺乳動物出生后卵巢中生殖細胞已經發育到了原始卵泡階段(此時生殖細胞被一層鱗片狀的體細胞包圍), 并停留在第一次減數分裂前期的雙線期, 之后這些卵泡或者凋亡或者在休眠一段時間后重新啟動發育。因此, 哺乳動物出生后沒有卵子的再生(neo-oogenesis)(Green & Zuckerman，1951)。自 20世紀50年代始, 以Zuckerman的結論為主, 在當時較多學者的證據支持下, 形成了哺乳動物卵巢“固定卵泡庫”的理論, 這一理論雄踞生殖生物學領域,并為教科書沿用至今。這似乎很容易解釋雌性哺乳動物的卵巢功能衰退較早的自然現象。但是, 從進化生物學的角度它很難解釋為什么雌性哺乳動物不利用干細胞產生新的雌性配子, 而要用含有更多遺傳突變的陳舊的雌性配子繁衍后代(如人類用于生殖繁衍的卵細胞多數已存在了 20～40 a), 同時,也難以解釋所觀察到的一些其他現象。因此, 仍有一些生殖生物學家一直致力于哺乳動物出生后是否存在卵細胞從頭發生的研究, 特別是最近 10年中, 生殖生物學家通過不同的方法和技術手段取得了一系列證據支持再生理論。本文將重點綜述新興的“再生理論”, 并提出哺乳動物卵巢生殖干細胞在研究過程中亟待解決的關鍵問題。

1 哺乳動物雌性配子發生的“再生理論”

支持“再生理論”的證據相當一部分來源于對卵巢卵泡數目的研究。按照傳統理論, 哺乳動物出生后卵泡數目應呈減少趨勢。但是, 小鼠卵巢中原始卵泡的數目在出生后相當一段時間內(如12～100 d)始終維持相對穩定, 不出現顯著下降趨勢（Johnson et al, 2004; Kerr et al, 2006), 且在生殖周期中還出現明顯波動（Johnson et al，2005); 殺傷生殖細胞的化學藥物致小鼠卵巢輕度或中度損傷后, 經過一段時間, 卵巢功能和卵泡數目可以得到一定程度的恢復(Johnson et al, 2005); 另外, 小鼠及非人靈長類動物卵巢卵泡的實際可使用時間遠遠超過通過數學模擬及實驗觀察推算出的理論卵泡凋亡頻率及消耗枯竭時間(Vermande-Van Eck, 1956; Johnson et al,2004; Kerr et al, 2006)。這些現象提示, 哺乳動物卵巢中可能存在新卵泡的發生和補給。

再生理論更為直接的支持證據是能進行 DNA復制的生殖細胞的發現。按照傳統的“固定卵泡”理論, 卵巢中所有的生殖細胞已發育到第一次減數分裂前期的雙線期, 不可能存在進行 DNA復制的生殖細胞。2004年, Johnson et al對青年和成年小鼠的卵巢進行體內 5'-溴脫氧尿嘧啶核苷(5'-bromodexyuridine, BrdU)標記(DNA 復制能力的標記), 并結合生殖細胞特異表達的標記分子 MVH（mouse vasa homologue)的檢測, 發現小鼠卵巢中的確存在能進行 DNA復制的生殖細胞（BrdU和MVH雙陽性細胞)。這類細胞位于卵巢表面上皮(ovarian surface epithelia, OSE), 數量在雌性小鼠青春期后急劇下降, 出生后30 d每個卵巢中有～63個細胞, 出生后40 d每個卵巢有～6個細胞。盡管這些能進行 DNA復制的生殖細胞的身份并不確定,它們可能是正進行有絲分裂的生殖干細胞或者前體細胞, 也可能是正進行減數分裂 DNA復制的生殖細胞, 但不管是哪種情況, 發現能進行DNA復制的生殖細胞已經極大地沖擊了傳統理論。

既然可能存在卵細胞的重新發生, 那么能重新生成卵細胞的細胞（生殖干細胞)存在于何處, 卵巢還是其他器官。2005, Johnson et al報道將健康小鼠的骨髓（bone marrow)或血液（periphery blood) 移植到經白消安(busulfan)處理導致卵巢功能衰退的小鼠中, 可以在受體小鼠卵巢內生成卵細胞樣細胞,但他們沒有通過受精和胚胎發育手段進一步驗證這些卵細胞樣細胞是否是真正的卵細胞, 并據此推斷骨髓或血液中可能存在生殖干細胞。但隨后其他團隊的研究證據很快否定了骨髓或者血液循環系統來源的細胞能再生出卵細胞（Eggan et al, 2006)。2009年, Niikura et al發現老年小鼠的卵巢中存在處于減數分裂前的Stra8（啟動減數分裂DNA復制的必需因子)陽性生殖細胞。他們將老年小鼠卵巢組織(其中的生殖細胞已通過轉基因標記了 GFP)移植到年輕小鼠卵巢中（其中的生殖細胞沒有GFP標記),六周后發現受體卵巢中出現了 GFP標記的卵母細胞。該結果提示卵巢中可能存在能產生新卵母細胞的減數分裂前生殖細胞, 但這些證據并不足以支持它們是卵巢中的生殖干細胞。另外, 其他研究人員(Bukovsky et al, 2005; Virant-Klun et al, 2008)也分別從小鼠或人卵巢表皮中獲得一類特殊的上皮細胞, 體外培養這些細胞可以進行分裂增殖, 它們表達Oct4、Nanog、Sox2、c-kit和SSEA4等, 并能分化形成形態上類似卵細胞的細胞(表達透明帶蛋白并形成類似透明帶的結構), 與顆粒細胞共培養還可形成卵泡樣結構。但這些研究均未能進行功能實驗, 未驗證這些卵細胞樣細胞是否能受精并發育形成健康的后代。由于沒有功能數據的支持, 這些實驗缺乏說服力。

直到2009年, 上海交通大學Zou et al獲得了功能證據支持卵巢中存在生殖干細胞的假說。他們從新生及成年小鼠的卵巢中分離出了一類生殖細胞,直徑為 15～20 μm, 這些生殖細胞能在特定的體外培養條件下分裂增殖, 具備高端粒酶活性, 表達生殖細胞的特異標記分子 MVH, 也表達某些胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESC)和原始生殖細胞(primordial germ cell, PGC)特異表達的基因(如Oct4、Dazl、SSEA1及 Blimp-1等), 但不表達減數分裂標記基因和卵母細胞表達的基因(如 Figla和ZP3)。短期或長期擴增后移植到經藥物處理的不育小鼠卵巢內能使其恢復生殖力 (Zou et al, 2011)。White et al (2012)基于流式分選的方法重復了Zou et al在小鼠上的實驗, 證實了小鼠卵巢中的確存在這樣一類生殖細胞, 它們可以在體外培養條件下增殖, 移植到卵巢中可以再生出正常卵細胞, 這些卵細胞能成功地進行體外受精并在體外發育形成囊胚(blastosphere)。更為震驚的是, 他們從成年女性的卵巢皮層組織中也分離到了類似的細胞, 并在體外成功進行了擴增培養, 這些細胞在分化條件下能自發形成35～50 μm的卵細胞樣細胞, 用GFP標記后注射到人卵巢皮質活體組織, 再移植到免疫缺陷鼠內, 可產生GFP陽性的卵母細胞。但由于倫理限制,這些卵細胞是否具備功能尚不清楚。這一研究不僅重復和證實了Zou et al在小鼠中的研究結果, 并指出人類卵巢中也存在類似的生殖干細胞。當然, 迄今為止還沒有更多的實驗室能穩定重復出Zou et al和White et al的研究結果, 其真實可信性還需要更多實驗室的獨立工作進行驗證。這些先鋒實驗工作的低重復性也反映了我們對這類細胞的特性仍知之甚少, 由此可導致實驗結果具很大的不確定性和不穩定性。

2 哺乳動物雌性配子發生的“固定卵泡理論”

盡管近年越來越多的證據表明哺乳動物卵巢內很可能存在生殖干細胞, 但不同的研究人員采取相似的方法卻得到了不一致的結果。例如, 2006年(Bristol-Gould et al, 2006)通過數學建模的方式對卵巢卵泡數目進行分析, 推算得出哺乳動物終身排出的卵的數目與出生時卵巢中卵子的數目相等的結論, 進而支持經典理論; Liu et al (2007)通過對成年女性卵巢中的生殖細胞進行增殖和減數分裂的標記基因表達檢測分析, 認為不存在生殖細胞的更新或卵母細胞的生成。

Begum et al (2008)進行了小鼠卵巢的移植實驗,并未發現卵巢中存在具再生能力的生殖細胞。這些結論上的差異可能來源于不同實驗室采用的具體檢測方法的細致性和靈敏性差異。例如Liu et al在他們的研究中并沒有檢測到表達NOBOX的生殖細胞, 而 NOBOX在成人卵巢中初級卵泡、次級卵泡中都應該有表達（Huntriss et al, 2006)。這表明Liu et al所用的方法對于檢測表達量很少的蛋白并不靈敏和適用（Zhang et al, 2008)。

Zhang et al (2012)因質疑Zou et al和White et al使用細胞質蛋白MVH 來分離和純化表達MVH 的生殖干細胞樣細胞的可行性和準確性, 采用Rosa26 rbw/+Ddx4-Cre的轉基因小鼠進行了系列研究。通過注射外源帶熒光標記的胚胎期12.5 d的卵巢細胞(包括體細胞和原始生殖細胞)到正常或受損成體卵巢中, 觀察是否有嵌合體卵泡形成從而來評判卵巢中是否存在新生卵泡的發生。由于沒有觀察到嵌合卵泡的生成, 他們認為卵巢中不存在卵泡的再生。另外, 他們還觀察了出生后小鼠卵巢中 MVH陽性和陰性細胞的體外增殖能力及移植到卵巢中的分化能力, 發現MVH陽性的卵巢生殖細胞不能增殖,而 MVH陰性的細胞雖然能增殖形成克隆, 但不具備分化形成生殖細胞的能力。基于上述結果, 他們認為小鼠出生后卵巢中沒有卵泡的再生。雖然此研究是目前支持固定卵泡理論最有力的證據之一, 但他們的工作也存在缺陷。首先, 可否將嵌合體卵泡的生成作為檢測受體卵巢自身是否存在卵細胞再生活動的標準尚不確定, 再者, 成體卵巢和胚胎期卵巢的細胞在分子特征上存在區別, 它們是否能在功能上有相互作用并能形成嵌合體未見報道。

3 展 望

哺乳動物卵細胞再生理論盡管取得了上述進展, 但目前的證據仍有明顯的不足之處。Zou et al和White et al的研究都采用了體外培養和移植的方法, 這些方法存在一定的缺陷, 即卵巢生殖干細胞的培養、擴增和移植是在非生理條件下進行的。一方面, 培養基中高濃度的生長因子有可能對細胞產生一定程度的重編程作用; 另一方面, 生殖干細胞移植到卵巢中, 干細胞的再生活動是在損傷的病理條件下進行。因此, 體外培養和移植的實驗仍無法回答最關鍵的科學問題, 即生理狀態下卵巢中是否真實地存在這樣一類生殖干細胞, 它們是否在正常生理條件下通過增殖和分化產生新的雌性配子, 從而維持卵巢的正常功能。

與體外細胞培養和移植的研究方法比較, 體內世系追蹤(in vivo lineage tracing)方法則能可靠地揭示生理狀況下干細胞的活動情況, 已廣泛應用于多種體內成體干細胞的研究, 如神經干細胞(Bonaguidi et al, 2011), 毛囊干細胞（Snippert et al,2010; Snippert & Clevers, 2011), 小腸干細胞(Carlone, 2009), 精原干細胞等（Nakagawa et al,2007; Nakagawa et al, 2010)。其基本原理是用熒光蛋白（如GFP)或者LacZ系統對干細胞進行永久性及無損傷性標記, 利用這些標記并結合細胞在不同分化和發育階段的特征, 跟蹤體內被標記的干細胞的命運。具體為首先需要知道研究的干細胞表達的特異標記分子, 然后利用 Cre-LoxP技術實現干細胞的標記。需要建立兩類轉基因工具小鼠, 一種為干細胞標記基因驅動表達Cre-ERT2轉基因工具鼠,另一種為報告轉基因小鼠(reporter mouse), 含Rosa26-loxp-stop-loxp-GFP/YFP/LacZ轉基因位點。兩種轉基因工具小鼠雜交后, 干細胞特異性標記基因驅動表達無重組酶活性的 Cre-ERT2融合蛋白,不能對LoxP位點進行重組和刪除。但體內注射雌激素類似物Tamoxifen或4-OH-Tamoxifen后即可誘導Cre重組酶激活, Cre隨即敲除loxP位點間的翻譯終止密碼子, 使 GFP/YFP/LacZ報告基因持續表達, 從而永久性標記上表達標記基因的細胞, 實現對細胞命運的在體示蹤 (Kretzschmar & Watt，2012)。采用體內世系追蹤技術研究生理狀態下卵巢中是否存在干細胞及卵細胞的再生活動, 將可能回答上述關鍵科學問題。但目前我們尚不知道采用何類特異性基因進行標記和示蹤, 因此尋找到適合的標記及示蹤因子將是在這一領域取得突破性進展的關鍵。在澄清生理條件下卵巢中是否存在生殖干細胞及卵細胞的再生現象以后, 繼續探索和研究卵巢生殖干細胞的再生活動規律、生殖干細胞異常與卵巢功能自然衰退及病理衰退的關系, 以及卵巢生殖干細胞的調控機制, 將有助于我們更全面深入地理解卵巢功能生理性和病理性衰退的機制, 并可能推動生殖干細胞在再生醫學中的應用（Bazer, 2004;Skaznik-Wikiel et al, 2007)。