淺談柑橘基因組芯片分析方法

楊雪蓮，貝學(xué)軍，朱友娟

(1.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025;2.西南大學(xué)，重慶 400716;3.阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 阿克蘇 843300)

1 引言

基因芯片是近年來科學(xué)界和商界迅速發(fā)展起來的一門生物高新技術(shù)。它是以分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物信息學(xué)、基因測序技術(shù)、微電子技術(shù)、高分子化學(xué)合成技術(shù)和激光技術(shù)發(fā)展及其有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物。

基因芯片技術(shù)在植物研究領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用。Affymetrix公司生產(chǎn)的Citrus Genome Array［1］芯片是第一個(gè)商品化的果樹基因芯片。該公司的柑橘基因組芯片在柑橘研究領(lǐng)域中做出了重大貢獻(xiàn)［2］，如易去皮、無核、提高風(fēng)味組成、去除有害物、疾病控制、提高營養(yǎng)特征和再生利用等方面都有所貢獻(xiàn)［3］。

Fujii等運(yùn)用22 K的柑橘寡聚核苷酸芯片研究發(fā)現(xiàn)乙烯受體蛋白Ⅱ(ETR2)在成熟果實(shí)中受外源乙烯的誘導(dǎo)，而其他乙烯受體不被誘導(dǎo)［4］。Agustí等人在含有7000個(gè)Unigene的cDNA芯片研究了外源乙烯對柑橘葉片離層與葉柄的基因表達(dá)譜差異，結(jié)果表明葉柄感受乙烯效果比葉片強(qiáng)烈［5］。Martinez－Godoy構(gòu)建了20 K cDNA芯片，用于不同種的柑橘品種基因表達(dá)分析，同時(shí)構(gòu)建了此芯片數(shù)據(jù)庫供用戶進(jìn)行基因芯片數(shù)據(jù)分析［6］。Liu等制作了柑橘cDNA芯片研究優(yōu)異芽變特性，結(jié)果顯示13個(gè)與編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因值得關(guān)注［7］。Cereos等構(gòu)建與柑橘果實(shí)成熟相關(guān)的cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)在柑橘果實(shí)發(fā)育過程中，檸檬酸代謝途徑為 γ 氨基丁酸(GABA)途徑［8］。

表達(dá)譜芯片在實(shí)際應(yīng)用中局限于其數(shù)據(jù)的分類或基因預(yù)測及芯片上相對基因功能分析。從生物芯片上凝聚的海量信息中找出重要信息需要將生物信息學(xué)知識和統(tǒng)計(jì)方法相結(jié)合。

2 基因芯片數(shù)據(jù)的預(yù)處理和歸一化

基因芯片數(shù)據(jù)的預(yù)處理是十分關(guān)鍵的步驟，是判定數(shù)據(jù)可靠性的基礎(chǔ)。基因芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理和歸一化直接影響后續(xù)分析的結(jié)果。寡核苷酸芯片采用高效多陣列分析法(RMA)、MAS、MBEI等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。

cDNA芯片的數(shù)據(jù)預(yù)處理主要包括通過數(shù)據(jù)過濾獲取需要的數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換滿足正態(tài)分布的要求、缺失值的估計(jì)彌補(bǔ)不完整的數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)歸一化、糾正系統(tǒng)誤差等內(nèi)容［9］。

基因芯片制作、雜交、信號掃描、數(shù)據(jù)輸出等過程所需成本較高，因此進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)時(shí)具有小樣本和大變量的特性，需要對輸出數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。數(shù)據(jù)歸一化起到調(diào)整由基因芯片技術(shù)引起的誤差，從而準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)芯片中信息變化。

3 差異基因的篩選方法

根據(jù)樣品分組進(jìn)行方差分析(ANOVA)，根據(jù)組間p≤0.05初選出組間表達(dá)差異(上調(diào)或下調(diào))2倍的基因。由于基因芯片實(shí)驗(yàn)上的局限，即使數(shù)據(jù)處理方法非常巧妙也難免產(chǎn)生大量錯(cuò)誤，Benjamini在1995年提出了一種方法，通過控制假陽性率(FDR)來決定p值的范圍［10］。在一張cDNA芯片一般假設(shè)表達(dá)的比值滿足正態(tài)分布，實(shí)際中常對比值取其Z值，則每條基因的Ζ值為Ζ=(Χ－μ)/σ，其中 Χ表示這表基因的表達(dá)比值，所有基因比值的平均值為μ，方差為σ。把±2作為Ζ值的判別標(biāo)準(zhǔn)時(shí)這種方法會選出5%的差異表達(dá)基因［11］。篩選差異表達(dá)可使用假設(shè)判定法，假設(shè)一個(gè)對數(shù)比值服從正態(tài)分布，給定一個(gè)界值和一個(gè)具體分布，可信水平或P值就是測量值由于隨機(jī)因素落在圖中的概率。若對數(shù)比值落在陰影中的基因原理對數(shù)比值的平均水平的位置，就被稱為差異表達(dá)基因［12］。還有方差分析法和噪聲抽樣法，及以最大似然估計(jì)方法為基礎(chǔ)的模型等均可用于差異基因篩選。

4 表達(dá)譜分析方法

4.1 聚類分析

聚類分析(Clustering analysis)是基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析最常用的多變量技術(shù)。聚類分析的對象可以是基因也可以是樣本或序列。通過聚類分析可以了解某一生物學(xué)途徑上催化一系列反應(yīng)的酶的表達(dá)規(guī)律，有助于闡明一些特殊的代謝通路和基因調(diào)控的機(jī)理。當(dāng)某些新基因與已知功能的基因歸為一類時(shí)，就可以推測并描述新基因的潛在功能。聚類結(jié)果還可以進(jìn)一步為難以進(jìn)行遺傳學(xué)處理和基因組序列不全的物種提供功能分析的切入點(diǎn)。基因芯片技術(shù)能監(jiān)測成千上萬的基因的表達(dá)情況，這就要求有全局的把握一些特別情況下和生物過程產(chǎn)生的基因轉(zhuǎn)錄水平分析，因此分析基因表達(dá)情況時(shí)要求把相近表達(dá)模式的基因進(jìn)行聚類。在基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)分析中，可應(yīng)用系統(tǒng)聚類分析、Bayesian聚類分析、K均值聚類分析、自組圖分析、主成分分析、二向聚類分析、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聚類分析等統(tǒng)計(jì)分析手段。

4.2 基因芯片數(shù)據(jù)的基因注釋和功能分析

對基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)解釋是基因芯片后期數(shù)據(jù)挖掘的一個(gè)重要方向但也是生物學(xué)瓶頸部位。解決這個(gè)問題可借助于各種生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫進(jìn)行后續(xù)分析。Ensembl數(shù)據(jù)庫、LocusLink數(shù)據(jù)庫、RefSeq數(shù)據(jù)庫、NAR數(shù)據(jù)庫(核酸研究);關(guān)于疾病信息:孟德爾遺傳信息數(shù)據(jù)庫(OMIM);蛋白質(zhì)家族信息:InterPro數(shù)據(jù)庫;轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)分析Transfac數(shù)據(jù)庫;功能分類:Gene Ontology數(shù)據(jù)庫、GOA數(shù)據(jù)庫;生物學(xué)通路和生物學(xué)相互作用的分析:KEGG、BioCarta數(shù)據(jù)庫、Transpath數(shù)據(jù)庫、GenMAPP數(shù)據(jù)庫等;生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)中的基因分析:CytoScape數(shù)據(jù)庫等。植物基因組功能注釋的基因家族數(shù)據(jù)庫(GreenPhylDB)，以NCBI為基因比對中心，結(jié)合其他數(shù)據(jù)庫對數(shù)據(jù)進(jìn)行特異性分析達(dá)到對研究對象的全面了解。

可用來分析柑橘基因芯片的數(shù)據(jù)庫有Citrus Functional Genomics Project(CFGP)、慕尼黑蛋白序列信息中心(MIPS)、harvEST、David及 AFFY提供的數(shù)據(jù)庫等。華中農(nóng)大完成甜橙基因組測序，并建立相關(guān)網(wǎng)站供柑橘研究者使用(網(wǎng)址為://citrus.hzau.edu.cn/orange/tools/blast.php)。柑橘中有13266條基因與擬南芥Unigene同源性很高，占柑橘基因組芯片的63%［13］，目前只能通過查看該探針在NCBI上的信息或者查找其與擬南芥或其他植物同源性很高的基因的GO信息來推斷其功能信息，需要逐一檢索，工作量很大。很多情況下，研究者根據(jù)自己感興趣的基因定義為一定名稱的基因集，當(dāng)其想要在一個(gè)表達(dá)基因列表中檢索這樣的基因集時(shí)，可以應(yīng)用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法精確檢驗(yàn)同源性，之后利用其他數(shù)據(jù)庫資源進(jìn)行同源性分析即可。

5 基因芯片在植物研究中的應(yīng)用

基因芯片可用于發(fā)現(xiàn)新基因。Aharoni等從草莓中分離了1701個(gè)cDNA克隆片段，構(gòu)建成微陣列芯片來研究草莓果的不同成熟時(shí)期果色與成熟度的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)了草莓乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因成熟果實(shí)的風(fēng)味合成中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用的，而且發(fā)現(xiàn)紅色果實(shí)比白色果實(shí)乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)活性高［14］。

寡核苷酸芯片用于研究植物基因的結(jié)構(gòu)。Winzeler使用高密度寡核苷酸微陣列研究14種不同的酵母菌株，發(fā)現(xiàn)兩種酵母株基因組結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在端粒區(qū)域，通過非同源序列之間的重組對酵母株基因組結(jié)構(gòu)加深了認(rèn)識［15］。Batista指出人們一直對轉(zhuǎn)基因作物對人體的潛在的危害存在很大爭議，Batista使用寡核苷酸芯片檢測水稻基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)誘變和轉(zhuǎn)基因相比誘變更廣泛程度上改變基因表達(dá)［16］。基因組芯片應(yīng)用為改良品種的食品安全評估提供一定的參考價(jià)值。

基因組芯片用于植物及其病害的基因表達(dá)檢測也有較大突破。Puthoff等使用Affymetrix的大豆基因組基因芯片，發(fā)現(xiàn)大豆胞囊線蟲病誘導(dǎo)大豆的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因豐量表達(dá)，參與乙烯代謝途徑、病原相關(guān)蛋白和抗逆蛋白相關(guān)基因大量產(chǎn)生［16］。

基因芯片應(yīng)用領(lǐng)域非常廣闊，已經(jīng)應(yīng)用于藥物篩選和新藥開發(fā)、疾病診斷、環(huán)境保護(hù)、司法鑒定、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、科學(xué)研究領(lǐng)域及生物傳感器等諸多領(lǐng)域，并且取得較好的成果。

6 結(jié)語

基因芯片技術(shù)可以用來篩選農(nóng)作物的突變基因，并尋找高產(chǎn)、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關(guān)基因，可以用于基因掃描及基因文庫作圖及商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。目前基因芯片對農(nóng)作物基因組測序做出了重要的貢獻(xiàn)。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，可將其運(yùn)用在新基因?qū)ふ摇z測基因表達(dá)水平、進(jìn)行后基因組學(xué)研究及轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測和植物檢疫等方面。根據(jù)市場實(shí)情，研究低成本、高效和快速檢測芯片是今后研究的重點(diǎn)。

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