SP600125對高血壓全腦缺血大鼠海馬區GPR78和CHOP表達的影響

趙雅寧， 李建民，劉 樂， 常學優， 陳長香， 李淑杏， 張 盼

內質網應激途徑是不依賴于死亡受體途徑和線粒體途徑的一條新的誘導細胞凋亡的重要途徑。已證實缺血、缺氧、能量匱乏等損傷因素可啟動內質網應激［1，2］;內質網應激通過整合細胞核、線粒體、高爾基復合體等亞細胞器反應，以決定細胞的轉歸:恢復、修復、損傷、加重或死亡。糖調節蛋白78(glucose-regulated proteins 78，GPR78)和 CAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP))是內質網應激的兩個經典標志物。高血壓并發腦梗死后細胞胞低氧、氧自由基、ATP耗竭、鈣穩態及炎癥反應等各種因素加重［3～5］，這些因素通過直接或間接地途徑引起內質網應激。JNK(CJunNH2-terminalkinases)稱為應激活化蛋白激酶(stress-activated MAP kinases，SAPK)，被認為是介導細胞損傷的重要通路，近年來的研究顯示JNK信號的激活與內質網應激有關。SP600125為JNK特異性抑制劑，可以特異性阻斷JNK信號通路活化，抑制神經細胞的死亡。但SP600125對高血壓腦缺血再灌注后內質網應激是否有影響，未見相關報道。本研究分別應用血壓正常大鼠和高血壓大鼠復制全腦缺血再灌注模型，應用SP600125進行干預，觀察對CHOP和 GPR78的表達的影響，初步探討SP600125對高血壓全腦缺血模型大鼠內質網應激的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)是目前國際公認的接近人類原發性高血壓病的動物模型，出生后5周齡SHR大鼠血壓開始逐漸升高，10周齡可達180mmHg［6］;Wistar-Kyoto(WKY)大鼠是與自發性高血壓大鼠相匹配的同源正常血壓大鼠，為SHR的正常血壓對照組動物。本實驗共用12周齡健康雄性WKY大鼠60只，60只同周齡雄性自發性高血壓大鼠，由北京維通利華實驗動物中心提供。抑制劑SP600125購自 Cell Signaling公司;多克隆 CHOP、GPR78抗體和內參β-actin購自Santa Cruz公司(美國);多克隆磷酸化JNK和CHOP、GPR78免疫組化試劑盒購自中杉生物有限公司(北京)。

1.2 動物分組和模型制備 60只雄性WKY大鼠隨機分為血壓正常假手術組和血壓正常全腦缺血再灌注組;另取60只雄性自發性高血壓大鼠分為高血壓全腦缺血再灌注組和JNK特異性抑制劑SP600125干預組。每組又隨機平均分為缺血再灌注6h、24h和48h時間亞組，各時間點入組動物10只。分別取WKY大鼠和SHR大鼠，采用改良的Pulsineli 4 血管阻斷(4-VO)法［12，13］制作大鼠全腦缺血模型:動物在水合氯醛麻醉下(350mg/kg)，切開動物頸正中，分離雙側頸總動脈，在其下置線備用;切開大鼠枕后部正中，暴露雙側第1頸椎橫突翼孔，直視下熱凝其下通過的椎動脈，電凝每次時間約2～4s，以翼小孔周圍骨質變白為標準，使翼小孔后雙側椎動脈永久閉塞。術后大鼠縫皮回籠，24h后以無創性微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，缺血30min后松開動脈夾，實行再灌注。缺血及再灌注期間用紅外線測溫儀監測耳內鼓膜溫度，并使之維持在37℃±0.2℃。應用HE染色觀察海馬區出現明顯的壞死神經細胞為判斷標準。假手術組:動物只進行麻醉，離暴露血管等處理，但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈。SP600125干預組術前30min側腦室注射SP600125 10μl，藥物在 5min內注完，留針 2min，其余操作同全腦缺血再灌注組。

1.3 腦組織形態結構觀察(蘇木伊紅染色)各組動物在規定時間點取5只動物，以戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，用40g/L多聚甲醛經左心室灌注固定后取腦，后固定24h梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，片厚5μm。切片二經甲苯脫蠟，梯度乙醇降至水，蘇木精-伊紅染色。每只鼠連續3張冠狀背側海馬切片，在有測微尺的光學顯微鏡(400×)下觀察海馬CA1區神經元形態變化并計數該視野下的存活神經元數量(有明顯細胞膜、細胞核、核仁為存活神經細胞)。具體方法:將CA1區平均分為3個等份，每個等份選取一個相同部位，計數其中每個視野(200×)下存活神經元數量，以每個視野下平均細胞數量表示。

1.4 CHOP、GPR78免疫組化檢測 切片常規脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復，分別滴加磷酸化JNK抗體(1∶150)、CHOP抗體(1∶200)和 GPR78抗體(1∶200)，濕盒中4℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV二步法)，37℃溫箱30min，DAB顯色，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片，陽性率的定量分析:鏡下觀察并攝片，陽性率的定量分析:每個標本取4張切片，將每張切片的CA1區平均分為3個等份，每個等份選取一個相同部位的4個視野，在有測微尺的光學顯微鏡下計數其中每個視野(400×)陽性神經細胞數。以每個視野下平均陽性細胞數量表示。

1.5 CHOP、GPR78免疫印跡法測定 大鼠致死后，迅速取雙側海馬區組織，稱量0.6g，4℃PBS充分洗滌，加入3倍體積的4℃全細胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心5min，12000r/min，取上清。考馬斯亮藍法測各樣本的蛋白含量，樣本貯存于-80℃備用。檢測步驟:蛋白樣品40μg與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10min，100g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，封閉液室溫下震蕩2～3h，加入抗體(CHOP和 GPR78均為 1∶2000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，標記的二抗，37℃孵育1h，TBST洗膜，ECL顯色，用圖像分析儀測定光密度，作定量分析。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計分析軟件對數據進行數據處理，檢驗方法為組間分析采用析因設計資料的方差分析，組內分析采用SNK-q分析。數據以均值 ±標準差()表示，P ＜0.05為有顯著性意義。

2 結果

2.1 SP600125對高血壓腦缺血海馬區神經細胞丟失的影響 各組海馬區存活神經細胞數量(見表1)。血壓正常腦缺血再灌注組各時間死亡細胞增多，死亡神經細胞表現為細胞輪廓模糊，排列紊亂，胞體收縮呈多角形或不規則，部分胞質自溶，各時間點存活神經元數量均明顯減少;高血壓全腦缺血再灌注組中海馬區神經元結構損傷加重，大部分胞質自溶，各時間點神經元細胞存活密度進一步降低，表明高血壓可增加腦缺血后的神經細胞丟失;SP600125干預組海馬區神經元部分結構完整，存活的神經元較缺血組明顯增多。

2.2 SP600125對高血壓腦缺血再灌注對CHOP、GPR78陽性細胞數量及表達的影響 免疫組化法檢測CHOP、GPR78陽性細胞數量(見表2、表3)。與血壓正常假手術組比較，血壓正常腦缺血再灌注組6h、24和48h時間點，GPR78陽性細胞增多，24h達高峰;與血壓正常腦缺血再灌注組比較，高血壓全腦缺血再灌注組中GPR78陽性細胞6h增多，24和48h時間點減少;與高血壓全腦缺血再灌注組比較，SP600125干預組中各時間點GPR78陽性細胞明顯增多;CHOP:與血壓正常假手術組比較，腦缺血再灌注組6h、24h和48h時間點CHOP陽性細胞均增多，24h達高峰，高峰持續至48h;與血壓正常腦缺血再灌注組比較，高血壓全腦缺血再灌注組中6h、24h時間CHOP增多，48h減少;與高血壓全腦缺血再灌注組比較，SP600125干預組中各時間點CHOP陽性細胞減少。

免疫印跡法檢測CHOP、GPR78蛋白表達水平:以β-actin校準后的蛋白條帶IOD值反映其磷酸化水平。結果顯示(見表4、表5)。與血壓正常假手術組比較，血壓正常腦缺血再灌注組中 CHOP、GPR78蛋白水平在各時間時間點明顯上調，其中GPR78 24h達高峰，CHOP高表達持續至48h;與血壓正常腦缺血再灌注組比較，高血壓全腦缺血再灌注組中GPR78蛋白水平6h增多，24和48h時間點減少;CHOP 6和24h表達增多，48h表達減少;與高血壓全腦缺血再灌注組比較，SP600125干預組中GPR78蛋白水平上調，CHOP在相應時間點下降。

表1 各組大鼠海馬區存活神經元數量比較(個/HP n=15，)

表1 各組大鼠海馬區存活神經元數量比較(個/HP n=15，)

與血壓正常假手術組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組26.65 ±4.36 20.86 ± 4.74*13.22 ±3.12#16.90 ±3.30△26.78 ± 4.40 17.81 ±4.36*10.68 ±2.18#14.26 ±3.00△27.28 ±4.60 15.12 ±2.64*8.86 ± 2.06#11.78 ±2.36△

表2 各組大鼠海馬區GPR78陽性細胞數量比較(個/HP n=15，)

表2 各組大鼠海馬區GPR78陽性細胞數量比較(個/HP n=15，)

與血壓正常假手術組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較，△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組2.25 ±0.70 8.21 ±1.12*12.44 ±1.64#15.96 ±1.86△2.32 ±0.68 18.67 ±1.44*8.22 ±1.64#14.10 ±1.63△2.40 ±0.75 12.64 ±1.16*6.20 ±1.21#11.05 ±1.57△

表3 各組大鼠海馬區CHOP陽性細胞數量比較(個/HP n=15，)

表3 各組大鼠海馬區CHOP陽性細胞數量比較(個/HP n=15，)

與血壓正常假手術組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較，△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組0.85 ±0.30 8.63 ±1.12*16.58 ±1.30#9.63 ±1.21△0.78 ±0.28 21.47 ±1.66*27.16 ±1.44#19.16 ±2.22△0.80 ±0.30 19.56 ±1.57*17.36 ±1.33#15.02 ±1.22△

表4 各組大鼠海馬區GPR78蛋白水平比較比較(n=15，)

表4 各組大鼠海馬區GPR78蛋白水平比較比較(n=15，)

與血壓正常假手術組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組0.043 ±0.021 0.132 ±0.034*0.162 ±0.024#0.188 ±0.036△0.052 ±0.020 0.183 ±0.034*0.130 ±0.018#0.159 ±0.021△0.047 ±0.018 0.158 ±0.026*0.115 ±0.014#0.140 ±0.020△

表5 各組大鼠海馬區CHOP蛋白水平比較(n=15，)

表5 各組大鼠海馬區CHOP蛋白水平比較(n=15，)

與血壓正常假手術組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組0.048 ±0.008 0.110 ±0.014*0.145 ±0.021#0.128 ±0.016△0.050 ±0.009 0.136 ±0.020*0.242 ±0.038#0.190 ±0.032△0.049 ±0.010 0.179 ±0.016*0.158 ±0.022#0.126 ±0.017△

3 討論

內質網是真核細胞中蛋白質翻譯合成和細胞內鈣離子的儲存場所。有害性刺激可打破內質網的穩態，出現錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內聚集以Ca2+平衡紊亂的狀態，稱為內質網應激(ERS)。GRP78是內質網重要的分子伴侶，參與蛋白質折疊修飾，并可以作為鈣結合蛋白維持細胞內鈣離子平衡;內質網應激過程中增多的GRP78使錯誤折疊蛋白正確折疊后，結合并抑制蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)和內質網跨膜蛋白肌醇酶l(IRE1)，內質網功能恢復，對細胞起到保護作用［7，8］。CHOP 正常情況下表達很低。在內質網應激反應時，PERK和IRE-1活化均能對CHOP產生誘導，CHOP過度表達則使細胞對內質網應激所致的凋亡更敏感［9］。本研究發現高血壓腦缺血組海馬區GRP78表達下降，CHOP表達增加，而存活神經元數量顯著減少，提示高血壓通過影響內質網應激誘導的GRP78和CHOP異常表達加重腦缺血后神經細胞丟失。

本研究發現SP600125預處理可顯著增加高血壓腦缺血后GRP78表達、下調CHOP表達，促進神經細胞的存活，提示SP600125可通過減弱內質網應激發揮對高血壓全腦缺血再灌注神經元損傷的保護作用。SP600125是JNK信號特異性的抑制劑，其藥理作用包括:可逆性地競爭ATP從而抑制JNK;呈劑量相關性地抑制c-Jun的磷酸化和炎性因子環氧化酶-2、白細胞介素-2、免疫反應性纖維結合腫瘤壞死因子-α 表達;抑制氧自由基的生成［10，11］。此外 JNK信號與多種通路如ERK通路、AKT通路存之間存在“網絡對話”。有研究顯示，抑制JNK信號通路，AKT通路活性增高;上調AKT活性，可上調GRP78表達，緩解缺血再灌注導致細胞內應激狀態［12，13］。因此推測SP600125可通過降低炎癥反應及氧化應激，減輕內質網穩態的失衡，或是通過“網絡對話”機制，使保護性信號通路活性增高，從而調節GRP78、CHOP表達水平，穩定細胞ER功能，增強細胞對高血壓加重腦缺血再灌注的耐受能力，促進神經元的存活。

總之，本研究發現SP600125可調控高血壓全腦缺血大鼠內質網應激誘導的GRP78、CHOP表達，對神經有保護作用。在高血壓腦梗死的治療和預防中，是否可以JNK信號為切入點，調整GRP78、CHOP的表達，調節內質網功能的平衡，以延緩和減少神經元的進一步丟失是我們需注意的關鍵問題。

［1］胡躍強，唐 農，雷龍鳴，等.大鼠局灶性腦缺血預處理后蛋白激酶樣內質網激酶及葡萄糖調節蛋白78表達的變化［J］.中華神經外科雜志，2012，45(1):45-52.

［2］Xu CY，Bailly-Maitre B，Reed JC，et al.Endoplasmic reticulum stress:cell life and death decisions［J］.Clin Invest，2005，115(10):2656-2664.

［3］張 金，李 陽，魏利華.高血壓對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷組織病理結構的影響［J］.中風與神經疾病雜志，2004，21(5):406-408.

［4］Ling L，Hou Q，Xing S，et al.Exogenous kallikrein enhances neurogenesis and angiogenesis in the subventricular zone and the peri-infarction region and improves neurological function after focal cortical infarction in hypertensive rats［J］.Brain Res，2008，24(6):89-97.

［5］曹紅波，吳 晏，高秀梅，等.天然牛黃對自發性高血壓大鼠腦細胞外液能量代謝及海馬組織SOD活性與MDA含量的影響［J］.時珍國醫國藥，2008，2:345-347.

［6］張艷榮，張連峰，楊志偉，等.高血壓實驗動物模型［J］.中華高血壓雜志，2008，16(3):205-210.

［7］Hayashi T，Saito A，Okuno S，et al.Induction of GRP78 by ischemic preconditioning reduce endoplasmic reticulum stress and prevents delayed neuronal cell death ［J］.Cereb Blood Flow Metab，2003，23(8):949-961.

［8］閆 穎，趙詠梅，趙志煒，等.內質網應激通路相關分子GRP78及CHOP在糖尿病腦病小鼠海馬表達的變化［J］.首都醫科大學學報，2011，32(1):90-97.

［9］Tajiri S，Oyadomari S，Yano S，et al.Ischemia-induced neuronal cell death is mediated by the endoplasmic reticulum stress Pathway involving CHOP［J］.Cell Death Differ，2004，11(4):403-415.

［10］Bennett BL，Sasaki DT，Murray BW，et al.SP6000125，an anthrapyrazolone inhibitor of Jun-N-terminal kinase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(24):13681-13686.

［11］Kim EM，Yang HS，Kang SW，et al.Amplification of the gamma-irradiation-induced cell death pathway by reactive oxygen species in human U937 cells［J］.Cell Signal，2008，20(5):16-24.

［12］Hong HY，Kim BC.Mixed lineage kinase 3 connects reactive oxygen species to c-Jun NH2-terminal kinase-induced mitochondrial apoptosis in genipin-treated PC3 human prostate cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，62(2):307-312.

［13］劉友平，嚴冬梅，陳川寧，等.PI3-K/Akt信號調控內質網應激對GRP78 的影響［J］.中國病理生理雜志，2011，29(4):749-754.