大鼠Nrn1基因3’UTR克隆及序列分析

菅輝玲， 程 江， 黃 瑾， 高 蕊，3

neuritin(Nrn1)基因是1996年Nedivi等通過大鼠光刺激誘導實驗，在視皮質中首次發現并報道的可塑性相關候選基因15(CPG15)。它是一種與神經系統可塑性密切相關的神經營養因子，能夠促進神經突起的快速生長與分支，在神經系統受損后發揮重要的再生修復作用［1～3］。研究表明Nrn1蛋白能促進大鼠急性脊髓損傷后傷區軸突再生，并能促進大鼠后肢運動功能的恢復，部分改善運動神經元軸突的缺失［4～6］。Nrn1基因 mRNA 的3’非編碼區(UTR)作為其mRNA的重要組成部分，可能與microRNA(miRNA)結合而被引導發生降解或翻譯受阻。miRNA是一類長度約18-25nt的內源性的非編碼 RNA，研究表明它與神經變性疾病相關［7，8］。

MiR-124能通過下調不利于神經元發育的眾多基因，誘導神經元的分化，調控軸突外生并促使其向正常功能發育［9～11］。Lee 等［12］在小鼠大腦中動脈短暫梗阻動物模型腦組織基因表達差異的篩查中發現部分miRNAs可能在神經元的損傷后修復中發揮重要作用。但是目前在國內外還尚未見到關于miRNA調控Nrn1基因的研究報道。

本實驗室前期采用solexa深度測序技術對腦缺血再灌注后2w及假手術大鼠腦組織的miRNA進行測序、比對和差異分析發現了部分差異表達的miRNAs，而且部分miRNAs與Nrn1蛋白表達呈此消彼長的現象［13，14］。

基于上述背景，為進一步驗證這些可能種子miRNA對Nrn1基因的調控作用，需對Nrn1 mRNA的3’UTR區進行克隆，并對序列進行生物信息學分析。本研究以大鼠為實驗研究對象，采用PCR技術克隆大鼠3’UTR區，并進行生物信息學分析;同時利用miRada軟件對3’UTR區miRNA可能結合靶標位點進行預測，期冀發現與 Nrn1密切相關的miRNA。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑 大腸桿菌DH5α感受態細胞購自天根生化(北京)有限公司;克隆載體EZ-TTM購自北京康潤誠業(北京)有限公司。Axyprep plasmid minipred Kit購自愛思進生物技術(杭州)有限公司;Wizard SV Gel and PCR Clean-up System購自Promega公司;Xho I和Not I限制性內切酶購自紐英倫生物技術(北京)有限公司;100bp、200bp DNA marker均購自TaKaRa;Taq DNA聚合酶等購自天根生化(北京)有限公司。

1.2 引物設計與合成 依據GeneBank發表的大鼠Nrn1序列(GenBank登錄號:NM_053346)，采用oligo 6.0軟件設計一對特異性引物，并在上游引物5’端引入了Xho I酶切位點，下游引物5’端引入了Not I酶切位點，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物信息如下(下劃線處為酶切位點):上游引物 F:5’-CCGCTCGAGACCTTAAGTCCGTCTTCACAC-3’;下游引物 R:5’-ATTTGCGGCCGCTCAAGGCTCTTTTATGTC-3’。

1.3 大鼠基因組DNA的提取 采取大鼠尾組織，酚/氯仿/異戊醇法抽提基因組 DNA，ddH2O溶解后，-20℃保存。DNA純度檢測OD260/OD280在1.8 ～2.0 之間。

1.4 大鼠Nrn1基因3’UTR的擴增 以大鼠基因組DNA為模板，PCR擴增Nrn1基因3’UTR，反應總體系為 25μl，其中上、下游引物各 0.5μl，模板1μl。PCR擴增反應程序為:94℃ 5min;94℃30s，55℃30s，72℃30s，共計35 個循環;72℃延伸10min。PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 大鼠Nrn1基因3’UTR的克隆、鑒定及分析 將PCR產物回收并純化后，克隆于EZ-TTM載體中構建EZ-TTM/Nrn1 3’UTR重組載體。將EZTTM/N1轉化E.coli DH5α并挑菌，利用菌落PCR初步鑒定陽性克隆。將初步鑒定陽性的克隆在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中過夜培養，用AXYGEN質粒提取試劑盒提取質粒，用XhoI、NotI進行雙酶切鑒定。選取陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定，并對測定結果進行分析。

2 結果

2.1 大鼠Nrn1基因3’UTR克隆及鑒定

2.1.1 大鼠Nrn1基因3’UTR克隆 PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，可見單一條帶，無非特異性擴增，片段大小均為649bp(見圖1)。

2.1.2 大鼠Nrn1基因3’UTR陽性轉化子的PCR鑒定 將回收并純化的Nrn1 3’UTR與EZTTM載體連接后轉化大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞培養過夜，隨機挑取9個單克隆菌落作為模板，進行PCR鑒定，1.5%，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果顯示1～9泳道均在約649bp處擴增出特異性條帶，初步鑒定為陽性克隆(見圖2)。

2.1.3 EZ-TTM/Nrn1 3’UTR 的雙酶切鑒定將菌落PCR初步鑒定的陽性克隆搖菌并提取質粒。抽提的重組質粒經 Xho I、Not I酶切后，可見約649bp的目的片段，大小與理論計算值相符。結果表明:Nrn1 3’UTR已成功插入EZ-T載體中(見圖3)。

2.1.4 EZ-TTM/Nrn1 3’UTR 重組質粒測序結果 將北京六合華大基因科技股份有限公司測序結果與GenBank中的大鼠Nrn1核苷酸序列進行比對，結果顯示:重組質粒所含的Nrn1基因3’UTR序列同源性100%。證明大鼠Nrn1基因3’UTR序列成功克隆。附:部分測序結果(見圖4)。

2.2 不同物種Nrn1基因同源性比較分析 分別對不同物種Nrn1基因的CDS區與3’UTR區進行同源性分析。結果顯示大鼠Nrn1基因的CDS區與小鼠、倉鼠、人、恒河猴、矮黑猩猩和豬之間同源性很高，均在97%以上;而不同物種3’UTR區呈現較大差異，大鼠、小鼠與倉鼠間同源性較高，均在84%以上，大鼠與人、恒河猴、矮黑猩猩、豬的同源性較低。通過繪制進化樹進一步分析，結果顯示大鼠與小鼠的親緣關系較近，與人、恒河猴、矮黑猩猩較遠(見圖5)。

2.3 靶位點預測及同源性分析

2.3.1 Nrn1基因3’UTR 區miRNAs預測 利用miRanda軟件預測大鼠Nrn1基因3’UTR區miRNA結合靶標位點，結果表明有11個 miRNAs在Nrn1基因上有結合位點，其中miR-204有兩個靶點(miR-204Target I和miR-204Target II)預測的分值與能值均較高，miR-758的靶標位點(miR-758 Target)分值雖最高但能值較低(見表1)。

2.3.2 不同物種間Nrn1基因miRNA預測結合位點比較與分析 根據miRanda軟件篩選的miRNAs靶標位點，利用DNAMAN軟件對不同物種的靶標位點進行同源性分析，結果顯示 miR-204TargetI和 miR-204TargetII在各物種 Nrn1基因3’UTR端同源性很高，均在85%以上。其中miR-204TargetI在大鼠、倉鼠、人、恒河猴、矮黑猩猩和豬之間同源性為100%，miR-204的第二靶點miR-204 TargetII在以上物種的保守性要低于第一靶點，形成兩類聚簇，大鼠、小鼠和倉鼠的序列保守性較高，人和靈長類動物恒河猴、矮黑猩猩之間同源率高達100%;相比之下 miR-758 Target和 miR-874 Target結合位點在各物種間差異較大，保守性較差，同源性僅為15%和34%。

表1 miRanda軟件預測大鼠Nrn1基因3’UTR靶標位點

圖1 Nrn1 3’UTR擴增產物電泳鑒定

圖2 Nrn1 3’UTR陽性克隆的PCR擴增產物電泳鑒定

圖3 Nrn1 3’UTR重組質粒的雙酶切電泳鑒定

圖4 EZ-TTM/Nrn1 3’UTR部分測序結果

圖5 不同物種Nrn1 3’UTR核苷酸的進化樹

3 討論

目前，神經修復與再生是一亟待解決的世界難題，神經營養因子Nrn1在此過程中發揮了重要作用。Rickhag等［15］研究發現腦損傷后Nrn1基因的表達上調，這與腦損傷后腦組織中某些特異表達的miRNAs發生變化形成了鮮明的相關性［16］。本課題組前期研究發現Nrn1蛋白在大鼠腦缺血再灌注模型后7d表達顯著上升，至14d達到最高值，21d后蛋白表達水平下降［14］;隨后miRNA高通量測序結果表明部分miRNAs的表達與Nrn1基因的表達變化趨勢相反，其中尤以 miR-204的表達最明顯［13］。提示Nrn1基因的表達可能受到miR-204調控。

不同物種基因3’UTR的序列存在較大差異，但是miRNA的結合位點在不同物種中保守性較強，這也是預測miRNA靶標基因的置信條件之一［17，18］。目前，國內外尚未見有關Nrn1基因的靶miRNAs的報道。本研究首次克隆大鼠Nrn1基因3’UTR核心序列并對其編碼區(CDS)和3’UTR序列進行生物信息學分析。研究結果表明Nrn1基因CDS在哺乳動物與人中高度保守，說明該基因在哺乳動物和人中可能發揮重要的作用，歷經長時間物種進化而亙古不變。各物種Nrn1基因3’UTR區同源性雖在70%以上，但物種間差異較大，在進化中經歷了序列變化與選擇的過程，該段序列可用于物種進化樹分析，精確地反映種屬親緣關系(見圖5)。研究同時發現3’UTR區有2個高度保守的區段，推測Nrn1基因3’UTR保守區段可能發揮著某種重要作用而得以進化保留。利用miRanda軟件發現了11個miRNAs的靶標位點，落在保守區且分值、能值比較高的miRNA只有miR-204，且miR-204兩個結合位點中miR-204 TargetI的分值、能值要較miR-204 TargetII高，提示miR-204 TargetI靶標調控Nrn1的可能性更大。以上實驗數據提供了miR-204與Nrn1基因3’UTR序列相結合的可能性，結合本課題組前期研究結果即Nrn1與miR-204基因表達量呈“此消彼長”的負相關，進一步說明miR-204具有靶標Nrn1基因的表達譜數據支撐和互作的生理、生化環境，提示miR-204在Nrn1基因表達調控中扮演著重要角色。本研究的結果為后續靶標關系的驗證以及深入探討相關miRNAs在Nrn1基因表達調控中的作用積累了基礎數據。

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