28種藥用植物提取液對6種植物病原真菌抑菌活性的測定

趙恭文 李長松 李 林 張 博 劉建軍 齊軍山*

（1山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東省植物病毒學(xué)重點實驗室，山東濟(jì)南 250100；3山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東濟(jì)南 250013）

植物是生物活性化合物的天然寶庫，其產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)超過40萬種，其中許多次生代謝物質(zhì)具有殺蟲或抑菌等生物活性，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥上具有重要的價值（Swant，1977）。利用植物資源對農(nóng)業(yè)病害進(jìn)行防治，具有資源豐富、環(huán)境友好、低毒、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢。Gould（1989）就曾報道了1 389種植物可以作為殺菌劑，其中包含的抗毒素、類黃酮和酚類等不同類型的化合物均具有殺菌或抗菌活性。孟昭禮和羅蘭（1998）從銀杏中分離出對植物病原菌有高活性的化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定、人工模擬合成，成功開發(fā)出綠帝系列農(nóng)用殺菌劑。Gautam等（2001）發(fā)現(xiàn)三葉鬼針草（Bidens pilosa）提取物對野油菜黃單胞菌水稻致病變種（Xanthomonas campestrispv.oryzae）、菊歐文氏菌玉米致病亞種（Erwiniachrysanthemipv.zeae）兩種細(xì)菌具有抑制作用，其中對野油菜黃單胞菌水稻致病變種的抑制作用更明顯。de Boer等（2005）發(fā)現(xiàn)6種非洲植物Coccinia adoensis，Cineraria grandiflora，Pavonia urens，Marattia fraxinea，Clutia abyssinicavar.usambarica和Vangueria infausta的乙酸乙酯、甲醇、冷水和沸水提取物對白假絲酵母（Candida albicans）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、黃色鐮孢菌（FusariuMculmorum）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、丁香假單孢菌（Pseudomonas syringaepv.syringae）和解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）均有抑菌活性。

我國藥用植物資源十分豐富，明朝的《本草綱目》記載了1 892種藥物，其中植物1 095種。《中國土農(nóng)藥志》（中國土農(nóng)藥志編輯委員會，1959）收錄土農(nóng)藥522種，其中包括植物性土農(nóng)藥403種。《中國有毒植物》（陳冀勝和鄭碩，1987）記載我國有毒植物 943種，有不少具有殺蟲抑菌活性。《中藥大辭典》（南京中醫(yī)藥大學(xué)，2006）收載藥物6 008味，其中大多為植物藥，且許多植物都具有殺菌功能（周志權(quán) 等，2001）。雖然藥用植物種類繁多，但只有極少部分做了抗菌、殺菌活性研究（嚴(yán)振 等，2005）。對有殺菌活性植物進(jìn)行篩選是開發(fā)植物源殺菌劑的前提和基礎(chǔ)，而鑒定、改造其中的殺菌成分是開展殺菌植物研究的重要方向。本試驗選擇28種藥用植物并對其殺菌活性進(jìn)行篩選，旨在為分離鑒定植物源農(nóng)藥先導(dǎo)化合物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試真菌

供試真菌瓜果腐霉（PythiuMaphanidermatum）和尖鐮孢菌（FusariuMoxysporium）分離自西瓜，茄鐮孢菌（FusariuMsolani）和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）分離自番茄，辣椒疫霉（Phytophthora capsici）分離自辣椒，禾谷鐮孢菌（FusariuMgraminearum）分離自小麥。所有病原真菌均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離純化、鑒定后保存。

灰葡萄孢分生孢子收集參照Doehlemann等（2005）的方法并稍加改進(jìn)。將灰葡萄孢接種于PSA培養(yǎng)基上，22 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后，再經(jīng)紫外燈誘導(dǎo)，通風(fēng)放置1～2 d，以無菌水輕輕洗脫孢子，過濾，1 000 r·min-1離心5 min，去上清液，加無菌水，再離心。最后用無菌水重懸至孢子濃度為1×105～1×107個·mL-1，并加入葡萄糖溶液至濃度為0.5%。

1.2 供試藥用植物

供試藥用植物共28種（表1），均購于濟(jì)南市建聯(lián)中藥店。分別陰干，粉碎，過20目篩。每種藥用植物稱取50 g干粉，用丙酮室溫下浸提3次，每次用150 mL丙酮浸提24 h。每次過濾前超聲波處理2次，每次15 min。過濾，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮并定容至50 mL備用。

1.3 抑菌活性測定

1.3.1 菌絲生長法 每種藥用植物提取液用0.22 μL針頭式細(xì)菌濾器過濾后取2.4 ML，加入45 mL PDA培養(yǎng)基中混勻（每亳升培養(yǎng)基中含有50 mg植物干粉），倒入直徑90 mm培養(yǎng)皿中，倒3皿。選擇事先培養(yǎng)好的生長均勻的菌落沿其邊沿用打孔器打直徑5 mm的菌餅，待培養(yǎng)基凝固后接種菌餅于中心。對照加2.4 ML的丙酮代替藥用植物提取液。瓜果腐霉19 ℃培養(yǎng)2～3 d，辣椒疫霉30 ℃培養(yǎng)7～8 d，尖鐮孢菌和茄鐮孢菌25 ℃培養(yǎng)6～7 d，灰葡萄孢21 ℃培養(yǎng)6～7 d，禾谷鐮孢菌27 ℃培養(yǎng)5～6 d，待對照快要長滿培養(yǎng)皿時用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值。計算抑制率，3次重復(fù)（陳年春，1991）。

1.3.2 孢子萌發(fā)法 把抑制菌絲生長效果較好的 5種藥用植物提取液旋蒸濃縮成浸膏，分別稱取1 mg，加入20 μL丙酮溶解，再用980 μL的0.1%吐溫80水溶液稀釋，各提取液均配成濃度為1 mg·ML-1的藥液。將各藥液依次吸取0.5 mL加入到不同的小試管中，然后吸取制備好的孢子懸浮液0.5 mL，分別使藥液與孢子懸浮液等量混合均勻。吸取上述混合液滴到凹玻片上，保濕適溫培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)，并設(shè)不含藥液的空白對照。待空白對照分生孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上時，檢查各處理分生孢子萌發(fā)情況，計算分生孢子萌發(fā)相對抑制率（NY/T 1156.1—2006）。

2 結(jié)果與分析

2.1 28種藥用植物提取液對6種植物病原真菌菌絲生長的抑制作用

供試的28種藥用植物提取液對6種常見植物病原真菌菌絲生長的抑制率見表1。有17種藥用植物提取液至少對1種病原真菌的菌絲生長抑制率在70%以上，占供試植物的60.71%。其中對供試的6種病原真菌抑制效果都比較好的為丁香；對5種病原真菌抑制效果較好的有烏梅、百部和木香；桂枝對瓜果腐霉、辣椒疫霉、灰葡萄孢和禾谷鐮孢菌等 4種病原真菌的抑制效果較好；黃岑對3種病原真菌抑制效果較好；漏蘆和豬牙皂對2種病原真菌抑制效果較好；對其中 1種病原真菌抑制效果較好的有檳榔、苦參、黃柏、川楝子、射干、白蘞、地膚子、菊花、虎杖。

表1 28種藥用植物提取液對6種植物病原真菌的菌絲生長抑制率

丁香、烏梅、百部、木香、桂枝等幾種藥用植物提取液抑菌譜廣且抑菌率高，說明其中含有廣譜殺菌的活性物質(zhì)，值得進(jìn)一步研究其中的活性成分。

2.2 5種藥用植物提取液對灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)的抑制作用

殺菌活性較好的 5種藥用植物丁香、烏梅、百部、木香和桂枝提取液對灰葡萄孢的分生孢子萌發(fā)都具有較好的抑制作用（表 2），這 5種藥用植物提取液對灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)相對抑制率均在90%以上，進(jìn)一步驗證了這5種藥用植物的殺菌活性，值得進(jìn)一步研究其殺菌成分。

表2 5種藥用植物提取液對灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)的抑制作用

3 結(jié)論與討論

本試驗采用菌絲生長法和孢子萌發(fā)法兩種方法都證明丁香、烏梅、百部、木香和桂枝具有較好的殺菌活性，特別是丁香抑菌活性高、抑菌譜廣。中藥丁香是桃金娘科植物丁香的干燥花蕾。丁香對多種霉菌和致腐菌的生長繁殖有抑制作用（周建新 等，2003；蔣志國和施瑞城，2006）。丁香中的抑菌成分有丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯、水楊酸甲酯、甲基正戊基酮、苯甲醛、乙酸芐酯等。丁香酚是丁香中的重要成分，占丁香油的70%～85%（南京中醫(yī)藥大學(xué)，2006）。近年來研究發(fā)現(xiàn)，丁香具有抗微生物、麻醉止痛、抗凝血、解熱降溫、保肝利膽和祛蚊等多種生物活性，而這些功效與丁香酚有著密切關(guān)系（邱電 等，2007）。

植物精油是植物體內(nèi)分子量較小，可隨水蒸氣蒸出，具有一定氣味的天然揮發(fā)性油狀液體物質(zhì)。植物精油具有廣泛的抑菌、殺蟲、抗氧化等活性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、飼料添加劑和食品防腐保鮮等方面有廣泛應(yīng)用（劉學(xué)文 等，2004；孫偉 等，2004；疏秀林 等，2006；張克英，2006；劉芳 等，2008）。本試驗篩選出的這幾種抑制植物病原真菌生長的藥用植物，其活性成分很可能在精油部分，有必要對其殺菌成分進(jìn)一步分離鑒定。

以植物丙酮提取液為材料篩選具有抑菌活性的植物很難完全反映植物體內(nèi)的真實情況，甚至?xí)┖Y。原因如下:第一，植物材料只取其藥用部分，并非全株；第二，植物干燥后，強(qiáng)揮發(fā)性的殺菌成分可能會散失；第三，選取丙酮為溶劑是因為其對病原菌毒性較小，但其提取能力未必最高，難以將極性和非極性的物質(zhì)都抽提出來；第四，測定抑菌活性選用粗提物，若殺菌成分含量低時未必檢出活性；第五，有些成分離體時抑菌活性很低，但在活體上抑菌活性很強(qiáng)。本試驗篩選出的抑菌活性較好的藥用植物的殺菌譜及其殺菌成分和作用機(jī)理均有必要進(jìn)一步研究。

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