貯藏時間對大蒜植株再生的影響

孫齊劉世琦張濤陳嫻孟凡魯

（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點試驗室，農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學重點開放實驗室，山東泰安 271018）

大蒜（AlliuMsativuML.）為百合科蔥屬蔬菜，在我國廣泛栽培，由于其花器官退化，多采用蒜瓣進行無性繁殖，較低的繁殖系數(shù)嚴重制約了大蒜生產(chǎn)的發(fā)展。為提高其繁殖系數(shù)，近年來對如何改進大蒜微繁擴繁技術進行了大量的研究（高山林和金雍安，2000；梁宏霞 等，2010）。大蒜離體繁殖主要有兩條途徑:一是通過大蒜離體再生途徑誘導愈傷組織，進而誘導產(chǎn)生不定芽及不定根；二是用大蒜外植體直接誘導生成不定芽。目前已建立了以莖尖（Novak，1983；趙俊麗 等，2003；于德才 等，2005；宋滿坡，2005）、根尖（張昌偉 等，2004）、全展葉（楊乃博，1981）、貯藏葉（周云羅 等，1980）、嫩葉（呂啟愚 等，1982）、莖盤切塊（薛寒青，2008）、花原始體（王洪隆 等，1992）和氣生鱗莖（袁學軍和李艷麗，2011）等為外植體的多種大蒜組織培養(yǎng)再生體系；探索了大蒜離體繁殖過程中的影響因素（薛萬新 等，1996；李志勇 等，1999）。

大蒜自5月底收獲，經(jīng)歷后熟、休眠后，到9月由于夜間溫度下降，大蒜鱗莖開始解除休眠（董宇 等，2009）。大蒜在貯藏過程中，鱗莖薄壁細胞衰退，其營養(yǎng)物質(zhì)供給幼芽萌發(fā)生長（張迎迎 等，2004；魏鳳菊 等，2005），伴隨著幼芽的不斷生長，鱗莖逐漸進入衰亡期，營養(yǎng)物質(zhì)含量下降，酶活性降低（婁成后，1981）。因此，尋找大蒜整個貯藏時期的最佳微繁擴繁時間有著重要的意義，但目前關于這方面的報道還不多見，僅報道了以大蒜休眠芽為外植體的愈傷組織誘導及植株再生（陳光宙 等，2011）。本試驗通過對金鄉(xiāng)大蒜整個貯存期的不同時期的鱗芽進行同處理的愈傷組織誘導及植株再生的研究，確定大蒜最佳微繁擴繁時間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2010年5月～2011年7月在山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學重點開放實驗室進行。供試大蒜品種為金鄉(xiāng)大蒜。

1.2 試驗方法

1.2.1 貯存條件 大蒜5月25日收獲后自然條件下貯存60 d（6、7月平均溫度分別為25.3、27.6 ℃），待外皮干燥時置于冷庫（-3 ℃）貯藏至翌年6月。

1.2.2 材料準備 將收獲的大蒜鱗莖放置于同一貯藏條件下，每30 d取200粒健康完整的鱗芽，分為2組:一組用于愈傷組織植株再生；一組用于外植體誘導不定芽。每組3次重復。鱗芽剝?nèi)ネ獗Ｗo皮，在流水下沖洗30～60 min，放入超凈工作臺，經(jīng)75%醫(yī)用酒精處理10～20 s后用0.1%升汞處理20 min，然后用無菌水沖洗6次，待用。

1.2.3 鱗芽愈傷誘導 將滅過菌的大蒜鱗芽切成0.3 cm×0.2 cm×0.2 cm的外植體，接入MS+2.0 mg·L-12，4-D的培養(yǎng)基內(nèi)，每瓶接種4個外植體，于光照強度為36 μmol·m-2·s-1（每天16 h）、溫度為25 ℃條件下培養(yǎng)，15～18 d繼代1次，記錄出愈時間，30 d后統(tǒng)計出愈率、出愈量、出愈情況。

1.2.4 植株誘導 將愈傷組織切割成0.5 cm×0.5 cm大小，轉(zhuǎn)接入MS+3.0 mg·L-16-BA的分化培養(yǎng)基內(nèi)，于光照強度為36 μmol·m-2·s-1（每天16 h）、溫度為25 ℃條件下誘導不定芽，待不定芽長到一定長度可看到假莖時將其取出，切除多余愈傷組織，接入生根培養(yǎng)基中，7 d后統(tǒng)計不定芽直徑、發(fā)芽率及平均發(fā)芽數(shù)。

1.2.5 莖盤不定芽誘導 將切除蒜踵的大蒜鱗芽莖盤切下，每個莖盤分為 4塊，厚度大約為 3 mm，接種于MS+2.0 mg·L-12，4-D+1.0 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基中進行不定芽誘導培養(yǎng)。每處理接種13瓶，每瓶接種4個外植體，每15～18 d換1次培養(yǎng)基，42 d后觀察不定芽的生長情況，統(tǒng)計不定芽誘導結(jié)果。然后將不定芽進行切割，接入生根培養(yǎng)基中，統(tǒng)計最早生根時間，7 d后統(tǒng)計生根率及平均生根數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 6.55和Excel軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 收獲后貯藏時間對愈傷組織誘導的影響

如圖1所示，隨著大蒜鱗莖貯藏時間的延長，大蒜外植體的最早出愈時間呈先減少后增加的趨勢，收獲后貯藏92 d的大蒜外植體出愈所需時間最少，為12 d；大蒜外植體的出愈率、出愈量及胚性愈傷組織的誘導率均呈先上升后下降的趨勢，出愈量在收獲后貯藏 61 d時最大，為2.06 g；出愈率和胚性愈傷組織的誘導率在收獲后貯藏92 d時達最大，分別為76.9%、100.0%。貯藏時間超過92 d后各指標顯著下降。可見大蒜誘導愈傷組織的最佳時期為收獲后貯藏61～122 d。

圖1 收獲后貯藏時間對愈傷組織誘導的影響

2.2 收獲后貯藏時間對不定芽誘導的影響

由圖2可見，收獲后貯藏61～306 d，由接種的外植體誘導出不定芽的直徑在1.0～1.2 cm之間；而收獲后貯藏336～366 d接種的外植體所誘導出的不定芽直徑為0.6 cm，與其他貯藏時間誘導所得不定芽直徑差異顯著；不定芽發(fā)芽率總體呈先上升后下降趨勢，收獲后貯藏61 d時達到最高點，為98.08%；收獲后貯藏30～214 d接種的外植體誘導出的不定芽發(fā)芽率變化不明顯，為 82.69%～98.08%，而收獲后貯藏 245～366 d接種的外植體誘導出的不定芽發(fā)芽率呈下降趨勢，最低可達61.54%。收獲后貯藏92 d時接種的外植體誘導的平均發(fā)芽數(shù)最多，平均每個外植體可誘導6.4個不定芽，收獲后貯藏366 d時最少，平均每個外植體誘導2.4個不定芽。可見誘導不定芽的直徑及發(fā)芽率受鱗莖貯藏時間影響不大，而平均發(fā)芽數(shù)受貯藏時間影響較大。

2.3 收獲后貯藏時間對不定根誘導的影響

由圖3可知，隨著大蒜鱗莖收獲后貯藏時間的延長，誘導大蒜不定根的最早生根時間先減少后增加，生根所需時間最少的是收獲后貯藏92 d時的接種處理，為6 d，而后誘導不定根需要的時間逐漸增長，最長時間為收獲后貯藏366 d時的接種處理，為21 d；生根率和平均生根數(shù)呈先增加后減少的趨勢，最大生根率為收獲后貯藏92 d時的接種處理，為98.33%，最少的為貯藏366 d時的接種處理，為15.00%；平均生根數(shù)最多的是貯藏61 d時的接種處理，為6.8條，最少的為貯藏366 d時的接種處理，為1.2條。

圖2 收獲后貯藏時間對不定芽誘導的影響

2.4 收獲后貯藏時間對外植體直接誘導不定芽的影響

由圖4可知，收獲后大蒜鱗莖貯藏92 d時外植體誘導不定芽所需發(fā)芽時間最少，為3 d，收獲后貯藏306～366 d時外植體誘導不定芽所需發(fā)芽時間最長，為7～8 d；不定芽發(fā)芽率在收獲后貯藏61～183 d較高，在67.31%～75.00%之間，收獲后貯藏183～366 d發(fā)芽率下降趨勢較明顯，最低可達19.23%；平均發(fā)芽數(shù)在收獲后貯藏30～122 d時均較高，在5.2～5.7個之間，收獲后貯藏245～366 d時平均發(fā)芽數(shù)顯著降低。可見由外植體直接誘導不定芽的發(fā)芽時間隨貯藏時間的延長呈先下降后上升趨勢，且變化幅度較小；而發(fā)芽率、平均發(fā)芽數(shù)總體呈先上升后下降趨勢，變化幅度較大。

圖3 收獲后貯藏時間對不定根誘導的影響

圖4 收獲后貯藏時間對外植體直接誘導不定芽的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，大蒜鱗莖收獲后貯藏 61～122 d時，誘導愈傷組織的出愈率、出愈量及胚性愈傷組織誘導率較高且出愈所需時間較短。這是由于在此期間大蒜鱗芽鞘的薄壁細胞由外至內(nèi)一層層衰退，將營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運到大蒜鱗芽中；與此同時，在大蒜自休眠至萌發(fā)的不同發(fā)育進程中，鱗莖中的酶活性增強，且在萌芽期酶活性變化最為強烈（魏鳳菊 等，2005）。隨著貯藏時間的延長，大蒜鱗莖結(jié)束休眠開始萌動，伴隨著幼芽的生長，鱗莖中營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，酶活性下降（婁成后，1981），上述指標開始降低。據(jù)劉淑嫻等（1996）研究發(fā)現(xiàn)，在不做任何處理和包裝的情況下，大蒜鱗莖在室溫貯藏 2個月中，隨著時間的推移呼吸作用增強，可溶性蛋白和 VC含量逐漸增強，而可溶性糖含量逐漸下降，據(jù)此推測可溶性糖的一部分作為呼吸基質(zhì)被消耗，另一部分可能被轉(zhuǎn)化為胚芽中的蛋白質(zhì)和VC。大蒜鱗莖中較低的酶活性以及較少的營養(yǎng)物質(zhì)不利于愈傷組織的發(fā)生，在本試驗中翌年3月（收獲后貯藏275 d）的大蒜鱗莖愈傷組織誘導率為 32.69%，少于湯青林等（2006）于 2004年 3月用大蒜鱗莖莖尖誘導大蒜愈傷組織的 60%的誘導率。造成這一差異的具體原因尚不清楚，可能是由大蒜的品種差異、收獲后貯藏條件差異及外植體選擇差異（李志勇，2000）引起的。

繼代培養(yǎng)時發(fā)芽率、平均發(fā)芽數(shù)、不定芽直徑，生根率、平均生根數(shù)均呈先上升后下降趨勢；生芽、生根所需時間則呈先下降后上升趨勢。比較愈傷組織的脫分化及再分化的趨勢線發(fā)現(xiàn)，兩者都與大蒜收獲后的貯藏時間密切相關，不同之處在于外植體脫分化誘導愈傷組織受大蒜鱗莖貯藏時間的影響較大。大蒜外植體再分化過程中的決定因素是愈傷組織的發(fā)育情況，例如黃色及淡黃色致密愈傷組織都可誘導出綠色芽點進而誘導出不定芽，白色疏松愈傷組織則不可以，此外胚性愈傷組織更有可能發(fā)育成為一株完整的植株。胚性愈傷組織的誘導率與作為外植體的大蒜鱗芽的生理生化狀態(tài)有關（李志勇，2000）；隨著貯藏時間的延長，大蒜的可溶性固形物、VC含量等都不斷減少，直至VC含量降至0（李瑜 等，2008），大蒜胚性愈傷組織誘導率也隨之降低。

研究收獲后貯藏時間對外植體直接誘導不定芽的影響發(fā)現(xiàn)，不定芽發(fā)芽率、平均發(fā)芽數(shù)呈先上升后下降趨勢；不定芽萌發(fā)所需時間呈先下降后上升趨勢。經(jīng)比較，大蒜外植體經(jīng)愈傷組織途徑誘導植株再生受貯藏時間影響較大。愈傷組織在經(jīng)過長時間培養(yǎng)后由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及次生物質(zhì)的代謝使生長環(huán)境越來越惡劣，增加了體細胞無性系變異及玻璃化苗出現(xiàn)的幾率（向鳳寧 等，1994；張恩讓，2003；張恩讓 等，2004），而由外植體直接誘導不定芽可避免這一情況的發(fā)生。此外，愈傷組織誘導不定芽發(fā)芽率受條件影響較大，不同光質(zhì)條件（馬琳，2010）、不同組織培養(yǎng)條件（李志勇，2000）均對愈傷組織內(nèi)含物有影響。

利用組織培養(yǎng)誘導金鄉(xiāng)大蒜植株再生的最佳時期是收獲后貯藏61 d（即8月大蒜打破休眠）至122 d（即幼芽萌動期），大蒜鱗莖營養(yǎng)物質(zhì)充足，酶活性較高，是大蒜微繁擴繁的最佳時期。隨著大蒜鱗莖內(nèi)幼芽的不斷生長，通過外植體—脫分化—再分化—再生植株的路線培育大蒜植株的增殖系數(shù)逐漸降低。

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