AG和AGPs對(duì)大白菜和普通白菜（小白菜）小孢子胚狀體誘導(dǎo)及成苗的影響

王愛杰 章 云 劉 洋 馮 輝

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧省十字花科蔬菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110866）

小孢子培養(yǎng)是創(chuàng)制雙單倍體的有效手段。自德國學(xué)者 Lichter（1982）首次報(bào)道甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）游離小孢子培養(yǎng)成功后，小孢子培養(yǎng)在結(jié)球甘藍(lán)、大白菜、花椰菜、普通白菜（小白菜）、黑芥、葉芥、青花菜、蘿卜等十字花科蔬菜作物上獲得了成功（Miyasaka et al.，1989；張鳳蘭 等，1994；王蒂 等，1996）。但是，對(duì)于一些特殊基因型材料如耐抽薹大白菜和耐抽薹普通白菜的小孢子培養(yǎng)仍然存在著胚誘導(dǎo)率低和成苗難等問題。

培養(yǎng)基是影響小孢子培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素（Ferrie et al.，2005）。徐艷輝等（2001）研究表明，NLN-13液體培養(yǎng)基中添加0.20 mg·L-1的BA對(duì)大白菜小孢子胚發(fā)生有明顯的促進(jìn)作用。韓陽等（2006）研究認(rèn)為，培養(yǎng)基中添加 0.10～1.00 mg·L-1的 NAA對(duì)大白菜小孢子胚的發(fā)生有抑制作用，且濃度越高抑制作用越大；2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）對(duì)小孢子胚的發(fā)生也有較強(qiáng)的抑制作用；細(xì)胞分裂素在較低濃度時(shí)能促進(jìn)胚狀體發(fā)生，較高濃度則抑制胚狀體發(fā)生，用ZT誘胚的適宜濃度為0.20 mg·L-1，用6-BA（6-芐氨基嘌呤）誘胚的適宜濃度為0.40 mg·L-1。路翠玲等（2004）報(bào)道，在NLN-13液體培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺、谷胱甘肽和L-絲氨酸可明顯促進(jìn)小孢子胚狀體形成。Zhang等（2011）研究表明，在 NLN-13液體培養(yǎng)基中添加PCIB（對(duì)氯苯氧異丁酸）對(duì)大白菜小孢子胚狀體形成和直接成苗有明顯促進(jìn)作用。

Letarte等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）和阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan-proteins，AGPs）對(duì)小麥（TriticuMaestivuML.）小孢子培養(yǎng)胚發(fā)生和直接成苗有促進(jìn)作用。AG是一類長的、高度支鏈的由阿拉伯糖與半乳糖組成的中性多糖（Hauer &Anderer，1993）。繆平等（1994）對(duì)罌粟花粉中AG的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)AG是由等量的阿拉伯糖和半乳聚糖組成。Günter和Ovodoy（2002）研究證明，麥瓶草（Silene vulgaris）愈傷組織中的AG具有免疫調(diào)控活性。AGPs是一類異質(zhì)性的糖蛋白，在植物的根、莖、葉、花和種子中均可發(fā)現(xiàn)，主要由蛋白質(zhì)和碳水化合物（糖類）組成，其蛋白質(zhì)部分的含量不超過 10%，富含羥脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，氨基酸含量和種類因物種和組織的不同而有變化。Kreuger和van Holst（1993）發(fā)現(xiàn)從胡蘿卜（Daucus carotaL.）種子中提取出的AGPs、或者從胡蘿卜胚性懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中提取出來的AGPs可以恢復(fù)非胚性細(xì)胞的胚性狀態(tài)。在擬南芥細(xì)胞培養(yǎng)（Gao & Showalter，1999）和煙草BY-2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（Chaves et al.，2002）中，AGPs可能與細(xì)胞程序性死亡相關(guān)。從結(jié)構(gòu)上說，AG是與 AGPs中的阿拉伯半乳糖類似的物質(zhì)，但與 AGPs相比，AG中沒有蛋白質(zhì)成分（Clarke et al.，1979）。

本試驗(yàn)以3個(gè)耐抽薹大白菜〔Brassica campestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕和3個(gè)耐抽薹普通白菜（小白菜）〔B.campestrisL. ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕一代雜種為試材，在NLN培養(yǎng)基中加入一定濃度的AG和AGPs，探討AG和AGPs對(duì)大白菜和普通白菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)和成苗的影響，以優(yōu)化小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2010年9月開始在遼寧省十字花科蔬菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試材料為3個(gè)耐抽薹普通白菜一代雜種:引自日本的冬賞味、先正達(dá)種子（北京）有限公司的博雅和國家蔬菜工程技術(shù)研究中心育成的京冠2號(hào)；以及3個(gè)耐抽薹大白菜一代雜種:引自韓國的金貝貝、黃心202和新理想。分3期播種，第1期于8月下旬將萌動(dòng)的種子在4 ℃冰箱中春化處理，大白菜春化處理30 d，普通白菜春化處理25 d。春化處理后的種子播于50孔穴盤，當(dāng)幼苗長至5片真葉時(shí)定植于溫室花盆中，12月中旬～翌年3月開花取樣。第2期和第3期試材各延遲30 d播種。

試驗(yàn)所使用的AG｛分子式:〔（C5H8O4）（C6H10O5）6〕X｝購于東京任成工業(yè)株式會(huì)社，AGPs（商品名:阿拉伯樹膠粉）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 小孢子分離與培養(yǎng)

小孢子分離純化和懸浮培養(yǎng)參照栗根義等（1993）和姜鳳英（2006）的方法。開花期采集健壯植株上花瓣長度與花藥長度比值在0.50～0.75之間的花蕾（小孢子發(fā)育處于單核靠邊期至雙核早期），每20個(gè)花蕾為1組，流水沖洗3次，經(jīng)70%乙醇溶液表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒8 min，無菌水洗滌3次，每次5 min。瀝干水分后，在B5液體洗滌培養(yǎng)基中用玻璃棒碾壓花蕾，擠出小孢子。小孢子懸浮液經(jīng)孔徑50 μm的尼龍網(wǎng)過濾后，收集于10 mL離心管中，1 000 r·min-1下離心3 min，棄上清液，重復(fù)2次，所得沉淀物即為純凈小孢子。

將分離純化后的小孢子用添加0、5、10、20、40 mg·L-1AG和0、10、100 mg·L-1AGPs的 NLN-13培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整小孢子濃度為 1×105個(gè)·ML-1。隨后用直徑60 mm的培養(yǎng)皿分裝，每皿5 ML，Parafilm膜封口。33 ℃條件下暗培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)至25 ℃下暗培養(yǎng)，待肉眼可見胚狀體時(shí)轉(zhuǎn)移到50 r·min-1搖床上繼續(xù)進(jìn)行暗培養(yǎng)，21 d后統(tǒng)計(jì)胚狀體數(shù)目，并轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基（添加30 g·L-1蔗糖和5.5 g·L-1瓊脂）中進(jìn)行繼代培養(yǎng)；21 d后統(tǒng)計(jì)直接成苗率、綠色組織率、愈傷率、褐化率和死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AG對(duì)小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響

由表1可知，在NLN-13培養(yǎng)基中加入一定濃度的AG，對(duì)小孢子胚狀體誘導(dǎo)有顯著影響。當(dāng)AG達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，供試品種的小孢子胚狀體誘導(dǎo)率最高，其中普通白菜冬賞味胚誘導(dǎo)率達(dá)到6.33胚·蕾-1，大白菜新理想達(dá)到7.67胚·蕾-1。

2.2 AGPs對(duì)小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響

由表2可以看出，AGPs對(duì)耐抽薹大白菜和普通白菜小孢子胚誘導(dǎo)有明顯的促進(jìn)作用。隨著培養(yǎng)基中AGPs濃度的增加，胚誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在 AGPs濃度為 10 mg·L-1時(shí)，胚誘導(dǎo)率達(dá)到最高，其中普通白菜博雅胚誘導(dǎo)率達(dá)到5.53胚·蕾-1，大白菜新理想達(dá)到8.40胚·蕾-1。

表1 NLN-13培養(yǎng)基中添加AG對(duì)大白菜和普通白菜小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)的影響

表2 NLN-13培養(yǎng)基中添加AGPs對(duì)大白菜和普通白菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響

2.3 培養(yǎng)基中同時(shí)添加AG和AGPs對(duì)小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響

在NLN-13培養(yǎng)基中同時(shí)添加10 mg·L-1AG和10 mg·L-1AGPs，對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)有更大的促進(jìn)作用，普通白菜冬賞味、博雅和京冠2號(hào)的胚誘導(dǎo)率分別為8.33、9.20胚·蕾-1和8.47胚·蕾-1，大白菜金貝貝、黃心202和新理想的胚誘導(dǎo)率分別為12.13、8.67胚·蕾-1和10.60胚·蕾-1，比單獨(dú)添加AG或AGP的處理胚誘導(dǎo)率增加了1倍左右。

2.4 AG和AGPs對(duì)小孢子胚狀體發(fā)育的影響

由表 3可知，在 NLN-13培養(yǎng)基中分別加入 10 mg·L-1AG、10 mg·L-1AGPs和 10 mg·L-1AG+10 mg·L-1AGPs，對(duì)大白菜及普通白菜胚狀體發(fā)育成苗均有一定的促進(jìn)作用，其中同時(shí)添加10 mg·L-1AG和10 mg·L-1AGPs的作用最大，可使供試品種的胚狀體終成苗率比不添加AG、AGPs處理提高1倍左右，達(dá)到80%以上；直接成苗率比不添加AG、AGPs的處理提高4～6倍，達(dá)到40%以上。添加AG、AGPs和AG+AGPs處理的胚狀體褐化率和死亡率明顯減少。

表3 AG和AGPs對(duì)大白菜和普通白菜小孢子胚狀體發(fā)育和成苗的影響

3 結(jié)論與討論

如何提高胚狀體誘導(dǎo)率是建立高效的游離小孢子培養(yǎng)體系的關(guān)鍵問題，在這方面前人已經(jīng)做過許多探索。Baillie等（1992）對(duì)不同基因型的大白菜小孢子培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，初始接種采用蔗糖濃度為17%的NLN培養(yǎng)基，48 h后更換到蔗糖濃度為10%的培養(yǎng)基中，可以使胚狀體誘導(dǎo)率提高，但是這種方法操作繁瑣，容易造成污染。外源激素對(duì)小孢子胚狀體形成和植株再生的影響至今也沒有取得一致的結(jié)果，徐艷輝和張凱（2000）認(rèn)為，培養(yǎng)基中添加0.2 mg·L-1BA可使大白菜小孢子胚誘導(dǎo)率顯著提高，但對(duì)難以成胚基因型材料的作用不大；張亞麗等（2009）對(duì)耐抽薹大白菜品系05BRF1-20、05BRF1-22和晚熟品種秦白3號(hào)進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，沒有誘導(dǎo)出胚。本試驗(yàn)添加AG和AGPs均可提高小孢子胚狀體誘導(dǎo)率，操作簡便，在一定程度上可以解決難出胚基因型材料的胚狀體誘導(dǎo)問題，但是本試驗(yàn)所采用的材料有限，并不能代表所有難出胚基因型材料，所以針對(duì)其他難出胚基因型材料還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，AG和AGPs對(duì)大白菜和普通白菜胚狀體的發(fā)育均有促進(jìn)作用，顯著提高胚狀體直接成苗率，降低胚狀體的褐化率和死亡率，這與Letarte等（2006）在小麥小孢子培養(yǎng)上的試驗(yàn)結(jié)果是一致的。van Hengel等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，從培養(yǎng)基或未成熟的胡蘿卜種子中提取出來的AGPs可全部恢復(fù)甚至提高體細(xì)胞胚發(fā)生能力。Egertsdotter和Vonarnold（1995）發(fā)現(xiàn)，從挪威云杉（Picea abies）種子中提取的 AGPs可以促進(jìn)挪威云杉懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚發(fā)育。Kreuger等（1995）研究證明，從胡蘿卜種子中獲得的AGPs可以促進(jìn)仙客來（Daucus carotaL.）胚性細(xì)胞團(tuán)的增加。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入AG和AGPs促進(jìn)大白菜和普通白菜小孢子胚狀體發(fā)生及直接成苗的作用沒有品種特異性。

在大白菜和普通白菜小孢子培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中添加10 mg·L-1AG、10 mg·L-1AGPs或10 mg·L-1AG+10 mg·L-1APGs，有利于胚性細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)育，降低小孢子胚狀體的死亡率，促進(jìn)胚狀體向著直接成苗的方向發(fā)展。其作用機(jī)制可能與AG和AGPs的多糖部分結(jié)構(gòu)有關(guān)，也可能與AGPs的蛋白成分有關(guān)，其機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

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