茄子耐鹽種質親緣關系的RAPD分析

吳雪霞查丁石朱宗文李賢

（上海市農業科學院園藝研究所，上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201403）

隨著設施栽培的快速發展，設施內土壤次生鹽漬化日趨嚴重，導致蔬菜作物的生長發育受到抑制，產量和品質降低，嚴重影響了蔬菜生產的可持續發展和蔬菜生產者的經濟效益（郭文忠 等，2004；黃毅和張玉龍，2004）。因此，如何克服設施內土壤鹽害，實現設施蔬菜生產的可持續發展，是目前生產上面臨的一個迫切問題。茄子（SolanuMmelongenaL.）在世界上大多數地區皆有栽培，尤以亞洲、非洲、地中海沿岸、歐洲中南部、中美洲種植廣泛，其中亞洲茄子產量占世界總產量的86%。目前茄子已成為我國設施栽培的主要蔬菜之一，土壤次生鹽漬化也嚴重影響了茄子的產量與品質。

對于鹽漬化土壤的利用主要采取兩種措施，一是用化學或物理方法改造土壤；二是通過生物技術培育耐鹽作物品種。前者不僅耗資巨大，且隨著大量化學物質的加入加重了土壤的次生鹽漬化。有效利用分子標記輔助育種技術，對于加快培育優質高產耐鹽茄子新品種具有重要的現實意義。因此，上海市設施園藝技術重點實驗室通過對上海市農業科學院園藝研究所茄子課題組現有茄子資源進行耐鹽鑒定，在篩選出芽期和幼苗期均耐鹽的 14份茄子種質資源的基礎上，對14份耐鹽茄子材料進行遺傳多樣性及親緣關系分析，為茄子耐鹽品種選育提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗共選用14份耐鹽茄子材料（表1），均經過2009～2010年2 a耐鹽性鑒定。

表1 供試茄子材料名稱及特征特性

1.2 試劑

試驗所用的提取DNA、PCR試劑和瓊脂糖均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3 模板DNA提取

分別取不同材料的幼葉，用CTAB法提取茄子基因組DNA，具體參照張永平等（2007）的方法。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度，-20 ℃冰箱內保存備用。

1.4 RAPD反應體系

RAPD擴增反應采用20 μL的反應體系，其中包含25 mmol·L-1MgCl22.0 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，5 U·μL-1TaqE 0.2 μL，10 ng·L-1模板 DNA 3.0 μL，0.1 μmol·L-1Primer 3.0 μL，滅菌雙蒸水9.3 μL，加蓋1滴礦物油進行擴增。擴增程序:94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min，35 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，5 個循環；94 ℃變性 1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min后4 ℃保存（馬金駿，2008）。

1.5 電泳檢測

PCR擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠（含EB）電泳分離，電壓120 V，時間約1.5 h，Gel DocTMEQ 170-8060凝膠成像儀進行觀察并拍照分析。

1.6 數據分析

選擇清晰的譜帶進行統計，擴增產物在相同遷移位置有條帶賦值為1，無條帶賦值為0，建立原始數據矩陣。應用NTSYS-pc（version 2.1）軟件處理并采用非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析（李懷志 等，2011），得到遺傳相似系數，并根據遺傳相似系數建立聚類分析圖。

2 結果與分析

2.1 RAPD標記的多態性分析

采用100個RAPD隨機引物對14份耐鹽茄子材料的DNA進行擴增，篩選出具有多態性且擴增條帶清晰的隨機引物10個。對這10個隨機引物的擴增結果進行統計，共擴增出 102條帶，其中多態性條帶 79條，多態性程度為77.45%。引物S28和S124的多態性位點比例較高，分別為84.62%和83.33%（表2、圖1）。

2.2 遺傳相似系數分析

利用遺傳統計學軟件對 RAPD擴增所得多態性位點進行分析，得出14份耐鹽茄子材料的遺傳相似系數在 0.316～0.975之間（表3），其中 E13與其他材料的的遺傳相似系數在0.316～0.405之間，E6與其他材料的遺傳相似系數在0.405～0.506之間，說明E13和E6與其他材料親緣關系較遠。E1和E3、E12和E14的遺傳相似系數最大，均為0.975，即兩者之間的親緣關系最近。

表2 RAPD引物擴增結果及多態性比例

圖1 引物S28和引物S124的RAPD擴增結果

表3 14份耐鹽茄子材料的遺傳相似系數

2.3 聚類分析

采用UPGMA法構建14份耐鹽茄子材料的遺傳關系聚類圖（圖2），在遺傳相似系數為0.47時，可將14份耐鹽茄子材料分為3類:第1類群只含有1份種質E13（CGN17497），來源于云南的茄屬野生近緣種SolanuMnigrumLinn，不能和栽培種進行雜交，更多的是具有雜草的性狀，沒有太多的利用價值；第2類群也只含有1份種質E6（Gilo），具有半栽培種的性狀，在栽培上用作砧木或作為觀賞茄，植株生長適應力強，抗病蟲，抗倒伏，果實中小扁圓形，果皮淺綠色，味道甘苦，和廣泛栽培的茄子雜交能獲得可育后代，是育種和遺傳研究中可以直接利用的材料；第3類群均為栽培種，包括12份材料（占總材料的85.71%），來源不同、形態各異。對類群3在遺傳相似系數0.805處切割，可分為2個亞類，第1亞類包含9份種質，除E5果實卵形、果皮為白紫色外，其余為長棒形或長卵形，果皮為黑紫色或綠色；第2亞類包括3份種質，E8、E9和E10，果實為長卵形或羊角形，果皮為白綠色或紅紫色。同時，第3類群同一亞類所包含種質均來自不同地方，因此推斷茄子所屬類群與地理來源無關。

圖2 14份耐鹽茄子材料聚類分析圖

3 結論與討論

從本試驗聚類分析結果來看，茄子遺傳親緣關系遠近與地理位置并無必然聯系，這與李懷志等（2011）的研究結果相同，這可能是由于茄子種植商業化，地區之間相互引種導致交流頻繁，使種質間地域差異性降低。同時本試驗中聚類分析首先將所有材料分為野生近緣種、半栽培種和栽培種3類，說明茄子材料間存在一定程度的遺傳分化，分子標記對遺傳變異比較敏感，對遺傳多樣性分析非常有效。

優異豐富的種質資源是育種工作的基礎，而種質基礎的寬窄和遺傳多樣性的豐缺、親緣關系的遠近則是育種成敗的關鍵。從本試驗結果來看，耐鹽栽培茄子材料間遺傳相似系數非常大，遺傳背景比較狹窄，對茄子耐鹽品種的選育非常不利，因此應加強種質的收集和創新工作，拓寬我國茄子耐鹽種質的遺傳基礎。在茄子耐鹽育種中應盡量選擇遺傳相似性系數較小，耐鹽性差異大的材料配制雜交組合。

郭文忠，劉聲鋒，李丁仁，趙順山．2004．設施蔬菜土壤次生鹽漬化發生機理的研究現狀與展望．土壤，36（1）:25-29．

黃毅，張玉龍．2004．保護地生產條件下的土壤退化問題及其防治對策．土壤通報，35（2）:212-216．

李懷志，張峻，李翔，陳火英．2011．應用SRAP標記對茄子品種進行遺傳多樣性分析與指紋圖譜構建．南京農業大學學報，34（4）:18-22.

馬金駿．2008．不結球白菜種質資源遺傳多樣性的初步研究〔碩士論文〕．揚州:揚州大學.

張永平，朱為民，崔輝梅．2007．上海地區番茄煙粉虱傳雙生病毒PCR檢測．上海農業學報，23（4）:100-101.