高效液相色譜法測定飼料中的氨基酸

(天津博納艾杰爾科技有限公司，天津300462)

氨基酸對動物的生長、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的正常代謝都有重要的作用，而且蛋白質(zhì)是動物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)，是評價飼料營養(yǎng)成分的一個指標，而氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，所以氨基酸的種類和含量也就是評價飼料質(zhì)量的根本依據(jù)，從而準確檢測氨基酸的含量和種類具有重要意義。柱后衍生的方法，雖然準確性高，但是耗時長、靈敏度低，所以本文采用柱前衍生的方法以縮短分析時間，增加靈敏度。同時該方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存數(shù)月，克服了柱前衍生法衍生物不穩(wěn)定的缺點，另外該方法準確性高，用標準品做未知樣品進行檢測，檢測的含量與標準品的標示值非常接近。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要儀器

飼料樣品1與樣品2為市售兩種不同品牌的飼料；Venusil AA氨基酸分析方法包(含衍生試劑PITC、氨基酸標準品、Venusil AA氨基酸分析專用柱4.6 mm×250 mm，5 μm)購自天津博納艾杰爾科技有限公司；氨基酸標準品(sigma公司)；水(屈臣氏4 L純凈水)、乙腈(色譜純，霍尼韋爾)；Agilent 1100高效液相色譜儀(包括紫外可變波長檢測器和高壓輸液泵)。

1.2 樣品前處理

酸水解法：準確稱取一定量的樣品，使樣品氨基酸總量在50～75mg范圍內(nèi)，置于20～30 ml安瓿瓶中，加入10 ml含0.1%苯酚的6 mol/l鹽酸，振搖使樣品溶解或者是樣品均勻分散在溶液中，將安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷凍3～5 min，充氮后用噴燈熔封，然后置于(110±1)℃烘箱中水解24 h，取出冷卻，取水溶液1 ml，置于濃縮管中用濃縮儀濃縮至干，加入1 ml的0.1 mol/l稀鹽酸溶解，用0.45 μm濾膜過濾后，取上清液貯存于冰箱中，供衍生使用。

1.3 衍生方法

準確量取水解后溶液及氨基酸標準品200 μl，分別置于1.5 ml離心管中，往每只離心管中準確加入正亮氨酸內(nèi)標50 μl，然后分別加入三乙胺乙腈溶液100 μl和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μl，搖勻室溫靜置衍生1 h。衍生結(jié)束后分別加入400 μl正己烷，振搖并靜置10 min，取下層溶液200 μl并用水稀釋到1 ml，混合均勻后用0.45 μm針式過濾器過濾即可。

1.4 檢測方法

1.4.1 溶液配制

流動相A：稱取15.2 g無水乙酸鈉,加水1 850 ml，溶解后用冰醋酸調(diào)pH值到6.5,然后加乙腈溶液140 ml,混合均勻并用0.45 μm濾膜過濾。

流動相B：80%乙腈水溶液。

1.4.2 高效液相檢測條件

儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀；

色譜柱：Venusil AA氨基酸分析專用柱4.6 mm×250 mm，5 μm，100 A；

流速：1 ml/min；

進樣量：10 μl；

檢測波長：254 nm；

柱溫：40℃；

檢測梯度見表1。

表1 流動相梯度變化

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 液相條件的建立

樣品中氨基酸含量比較低，而且直接檢測溶劑效應(yīng)較大，經(jīng)過衍生后直接檢測樣品中的氨基酸不能完全分離，本文通過用水稀釋衍生溶液的方法降低檢測中的溶劑效應(yīng)，并且經(jīng)過優(yōu)化流動相梯度使18種氨基酸得到良好的分離。

但是實際檢測過程中相同的檢測條件下，儀器不同，分離效果差別較大，有的甚至都完全分不開，為此本文還開發(fā)了一種基礎(chǔ)檢測條件，可以根據(jù)儀器的自身特點，稍加調(diào)整流動相的比例即可使18種氨基酸得到較好的分離?；A(chǔ)檢測條件如表2所示。

表2 流動相基礎(chǔ)梯度變化

2.2 檢測方法的穩(wěn)定性、線性及準確性

氨基酸標準品按照1.3節(jié)方法衍生后，相同的條件（1.4.2節(jié)）下連續(xù)重復進樣6次，計算相對標準偏差，結(jié)果如表3所示。由結(jié)果可知該方法比較穩(wěn)定，可以用來檢測氨基酸樣品，其實驗圖譜如圖1所示。

表3 氨基酸的線性回歸方程、標準偏差和檢出限

根據(jù)儀器對各個物質(zhì)的響應(yīng)情況，將氨基酸標準溶液分別稀釋成2.5 μmol/ml(胱氨酸為1.25 μmol/ml)、1.25 μmol/ml（胱氨酸為 0.625 μmol/ml）、0.5 μmol/ml（胱氨酸為 0.25 μmol/ml）、0.25 μmol/ml(胱氨酸為0.125 μmol/ml)、0.125 μmol/ml(胱氨酸為0.0625 μmol/ml)5個濃度，然后按照1.3節(jié)的衍生方法同時衍生處理，樣品經(jīng)稀釋過濾后在相同的實驗條件下（1.4.2節(jié)）進樣，依據(jù)進樣濃度X（μmol/ml)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，根據(jù)各個物質(zhì)峰高、噪音，遵循S/N=3計算出最低檢出限，回歸方程及檢出限見表3?？梢?，在選定的液相色譜條件下氨基酸標準溶液的響應(yīng)與濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 氨基酸標準偏差試驗色譜

為了驗證建立方法的準確性，本文用Sigma氨基酸標準品為樣品，以博納艾杰爾科技的標準品為標準品通過相同的方法（1.3節(jié)）衍生后，按照相同的條件（1.4.2節(jié)）檢測得出檢測值與標示值之間的偏差，除胱氨酸外，偏差均小于3%，接近標準品的標示值，證明該方法準確性高，檢測效果穩(wěn)定。實驗結(jié)果如表4。

表4 檢測Sigma標準品的相對誤差

因為半胱氨酸在堿性環(huán)境下能夠轉(zhuǎn)化成胱氨酸，所以經(jīng)堿水解后胱氨酸的含量不穩(wěn)定，此外有時兩個半胱氨酸殘基會發(fā)生二硫鍵交聯(lián)，經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不穩(wěn)定，非常容易分解，所以胱氨酸的相關(guān)系數(shù)和偏差都比較大。

2.3 樣品檢測結(jié)果

按照上述方法檢測處理后的飼料樣品可得色譜圖如圖2、圖3，通過單點校正法可以得出樣品1和樣品2中含有標準品中的17種氨基酸。

樣品中的17種氨基酸均能得到良好的分離，這說明在有基質(zhì)干擾的情況下本文建立的這種方法同樣適用，而且樣品連續(xù)進樣重復性非常好，未出現(xiàn)樣品變質(zhì)或者峰型變差的現(xiàn)象，證明本文建立的方法在有基質(zhì)干擾的情況下也同樣克服了衍生氨基酸容易分解的問題。

3 實驗結(jié)論

按照上述實驗條件，可以準確檢測飼料樣品中17種氨基酸，同時檢測的靈敏度及線性都能滿足檢測的要求，而且本方法準確性高，與樣品中含有氨基酸的真值偏差非常小，所以該方法可以準確的檢測飼料樣品中的氨基酸。

圖2 實際樣品1色譜

圖3 實際樣品2色譜

[1]胡鑫鸚,盛翠鳳.淺議飼料分析的高效液相色譜法[J].科技資訊,2008,28(2):221.

[2]瞿其署,湯曉慶,胡效亞,等.柱前衍生法在氨基酸分析中的應(yīng)用[J].化學進展，2006,18（6）：789-793.

[3]楊菁,孫黎光,白秀珍,等.異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法同時測定18種氨基酸[J].色譜,2002,20(4):369-371.

[4]中華人民共和國國家標準飼料中氨基酸的測定.