飼料中硝基呋喃類藥物免疫膠體金檢測試紙條的研制

（北京勤邦生物技術有限公司，北京102206）

硝基呋喃類藥物（Nitrofurans）是一類人工合成的具有5-硝基呋喃基本結構的廣譜抗生素，主要包括呋喃唑酮（furazolidone）、呋喃西林(nitrofurazone)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、呋喃它酮(furaltadone)，主要用于敏感菌所致的細菌性痢疾、腸炎、球蟲病的預防和治療。硝基呋喃類藥物具有較強的致癌、致突變、致畸等副作用，嚴重危害人體健康，歐盟和日本均已禁止在食品中使用硝基呋喃類藥物，我國也規定在飼料生產中全面禁用[1-3]。

目前硝基呋喃類藥物殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法[4-5]，超高效液相色譜串聯質譜[6]、液相色譜-紫外法[7-8]、酶聯免疫法[9-10]等，上述檢測方法操作繁瑣，成本高，并且需要由受過專業訓練的技術人員來完成，不適合現場監控和大量樣本篩查。試紙檢測方法具有操作簡單，檢測所需時間短，攜帶方便，靈敏度高等優點，適合現場大量樣本的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 試劑

氯金酸、檸檬酸三鈉、甲醇等化學試劑均購自北京化學試劑公司；呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、牛血清白蛋白、卵清蛋白購自sigma公司。

1.2 儀器

磁力加熱攪拌器（常州國華生產），數控切條機CT300（上海金標生產）、連續式劃膜儀HM8000（上海金標生產），其余均為實驗室常規儀器。

1.3 方法

1.3.1 試驗動物

8周齡的雌性Balb/C小鼠。

1.3.2 硝基呋喃類藥物半抗原合成

取2-醛基-5-硝基呋喃1.41 g與氨基丁酸2.0 g溶入150 ml甲醇中，加入10 ml三乙胺，室溫下反應10～20 h，稀鹽酸酸化，乙酸乙酯萃取，蒸除溶劑后，柱層析得到硝基呋喃類藥物半抗原。

1.3.3 硝基呋喃類藥物免疫抗原和包被抗原的合成

1.3.3.1 免疫抗原合成

取上述步驟得到的硝基呋喃類藥物半抗原18mg，溶解于1.5 ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中；取36mg碳化二亞胺（EDC）用0.2 ml水充分溶解后，加入上述DMF中，室溫下攪拌24 h，得到Ⅰ液；稱取OVA60mg，使之充分溶解在5.3 ml PBS(pH值7.2)中，得到Ⅱ液；將上述得到的Ⅰ液逐滴緩慢滴加到Ⅱ液中，并于室溫下攪拌24 h；用0.01 mol/l PBS，4℃透析3 d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質，分裝，于-20℃保存備用。

1.3.3.2 包被抗原合成

取上述步驟得到的硝基呋喃類藥物半抗原25mg，溶解于1.5 ml DMF中，取50mg EDC用0.2 ml去離子水充分溶解后，加入上述DMF中，室溫下攪拌24 h，即可得到Ⅲ液；稱取BSA 60mg，使之充分溶解在4.3 ml PBS（pH值7.2）中，得到Ⅳ液；將Ⅲ液逐滴緩慢滴加到Ⅳ液中，并于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/l PBS 4℃透析3 d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質，分裝，于-20℃保存備用。

1.3.4 生產硝基呋喃類藥物單克隆抗體的制備

用150 μg的硝基呋喃類藥物免疫抗原與等量FCA混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射。二免和三免時，將FCA換成FIA劑量和方法同上，每次免疫間隔時間為2周，三免后第7 d，小鼠尾部靜脈采血，室溫靜置1 h，4 ℃過夜，12 000 r/min離心10 min，收集血清，4℃保存，用間接ELISA法測定血清效價，待效價較高時，按照150 μg/只的劑量腹腔注射加強免疫。3 d后取小鼠脾臟進行細胞融合，以有限稀釋法篩選陽性克隆，并按照常規方法制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化。用SDS-PAGE法進行純化后的硝基呋喃類藥物單克隆抗體電泳檢測,濃縮膠濃度為5 g/100 ml，分離膠濃度為10 g/100 ml，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，結果見圖1。

圖1 抗體電脈鑒定

純化的單克隆抗體經SDS-PAGE顯示，在變性解鏈狀態下有兩條帶，一條為輕鏈，位于24.5 kD處；一條為重鏈，位于50.0 kD處，純度較高，濃度較大，無雜蛋白，抗體純化效果較好。

1.3.5 免疫膠體金試紙主要反應條件的確定

1.3.5.1 膠體金的制備

用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置于磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，每100 ml 0.01%氯金酸加入2 ml、1%檸檬酸三鈉，繼續煮沸，至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫后補足失水，用肉眼觀察，可見膠體金溶液外觀呈酒紅色，均勻度較好、無雜質、透明度較高。用電鏡掃描，膠體金顆粒的粒徑為20 nm左右，結果見圖2。

圖2 膠體金電鏡掃描

1.3.5.2 膠體金標記抗體

在磁力攪拌下，用0.1 mol/l碳酸鉀調膠體金的pH值至8.2，按每毫升膠體金50～100 μg抗體的標準向膠體金溶液中加入硝基呋喃類藥物單克隆抗體，繼續攪拌混勻30 min，加入10%BSA至BSA在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置30 min。12 000 r/min，4℃離心30 min，棄上清液，沉淀用含有0.1%牛血清白蛋白，0.08%吐溫-80和0.3%吡咯烷酮的復溶緩沖液洗滌2次，用體積為初始膠體金體積1/20的復溶緩沖液將沉淀重懸，得到的金標抗體溶液，置4℃備用。將羊抗鼠二抗點樣于硝酸纖維素膜上，直接與金標抗體反應，可見有明顯的粉紅色斑點，表明金標抗體有活性。

1.3.5.3 硝酸纖維素膜的選擇

將抗原適當稀釋后通過點樣方式分別包被在milipore90、milipore135和mdi70三種硝酸纖維素膜上，經干燥、組裝試紙條后，發現不同孔徑及廠家的硝酸纖維素膜點樣后，均能顯色，但顯色程度略有不同，milipore135顯色最深，milipore90和 mdi70差別不大，milipore135層析速度較慢，不利于樣本層析，milipore90試劑展開速度較milipore135快，但不及mdi70。mili?pore90與mdi70上檢測線顯色情況相差不多，但mdi70背景顏色較淺。綜合層析速度與顯色情況，三種硝酸纖維素膜中，mdi70更符合檢測要求。

1.3.5.4 結合墊、樣品墊和吸水墊的選擇

分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種不同材質材料作為結合墊及樣品墊組裝試紙條，在結合墊處滴加2 μl、10%的金標抗體，滴加70 μl的陰性飼料樣品液，QXLM對飼料樣本的吸收能力較好，層析速度較快且顯色較深，故選擇QXLM作為結合墊和樣品墊。吸水墊選擇吸水能力較好，質地均勻的Cotton linters300，厚度2.59。

1.3.5.5 結合墊的包被

將結合墊浸泡于pH值7.2，含有5%牛血清白蛋白，0.05 mol/l磷酸鹽緩沖液中浸濕1 h，37℃烘2 h；用劃膜儀將金標抗體包被在結合墊上，每1 cm結合墊包被0.01 ml金標抗體，置于37℃環境中60 min后取出，置于4℃環境中保存備用。

1.3.5.6 樣品吸收墊的處理

將樣品吸收墊置于pH值7.2，含2%小牛血清，1%活性劑，0.2 mol/l磷酸鹽緩沖液浸泡2 h，37℃環境中2 h后備用。

自以為瞞天過海，常常暗自慶幸，他哪里想到，他的一切舉動盡在妻子掌握之下。那么她拍這些照片要干什么呢？其動機似乎不完全是為了拿到自己背叛的證據。既然有了確鑿的證據，為什么遲遲不向自己攤牌呢？仔細回味，妻子似乎沒什么反常啊？她怎么會如此鎮定？看來他低估了妻子的能力，低估了妻子的心機。

1.3.5.7 硝酸纖維素膜的處理與包被

用pH值7.2，0.01 mol/l磷酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋到1mg/ml,用劃膜儀將其包被于硝酸纖維素膜的檢測線(T線),包被量為1 μl/cm；用pH值7.2,0.01 mol/l磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠二抗稀釋到1mg/ml，用劃膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質控線（C線），包被量為1 μl/cm。

1.3.5.8 包被原包被時間的確定

在硝酸纖維素膜上包被抗原后，置于37℃烘箱中干燥，時間設置為30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h，待滿足干燥時間后，同時對陰性飼料樣本進行檢測，從節約時間及成本考慮，選擇包被抗原的硝酸纖維素膜在37℃干燥8 h。

1.3.5.9 金標抗體干燥條件的確定

用pH值7.2，0.01 mol/l磷酸鹽緩沖液將金標抗體稀釋到1∶2，取5 μl涂布在結合物墊上，分別置于室溫、37 ℃條件下干燥，時間設置為10、20、30、60、120 min，結合墊在室溫、37℃下干燥時間大于30 min時檢測結果差異不顯著，為減少外界因素對試驗的影響，最終選擇37℃下干燥60 min作為結合墊干燥條件。

1.3.5.10 檢測線（T）、質控線（C）包被濃度及線寬的確定

利用已確定包被液將抗原與羊抗鼠二抗分別進行不同倍數稀釋，并制備成試紙條檢測，綜合考慮陰性顯色程度與陽性樣本添加測試確定在硝酸纖維素膜上的抗原濃度為0.09mg/ml，線寬為0.12 μl/cm，羊抗鼠二抗濃度為0.13mg/ml，線寬為1.0 μl/cm。

試紙條組裝按照常規檢測試紙條組裝模式[11]。

2 結果與分析

2.1 飼料樣本的前處理

稱取(1.0±0.05)g飼料樣品至聚苯乙烯離心管中，加入5 ml、50%甲醇水溶液，渦動，靜置，取上清液用于檢測。

2.2 試紙條技術指標的測定

2.2.1 試紙條檢測限

在空白飼料樣本中添加0、2.5、5、10 μg/kg的呋喃唑酮，0、1、3、6 μg/kg的呋喃它酮，0、1、2、4 μg/kg的呋喃西林，0、1、2、4 μg/kg的呋喃妥因，取試紙條進行檢測，每個樣本重復測定3次。

對呋喃唑酮的測試結果為：滴試0、2.5 μg/kg濃度時，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性，當滴試5、10 μg/kg濃度的標準液時試紙條檢測線不顯色，呈陽性，表明，本試紙條對呋喃唑酮的檢測限為5 μg/kg；

對呋喃它酮的測試結果為：滴試0、1 μg/kg濃度時，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性，當滴試3、6 μg/kg濃度的標準液時試紙條檢測線不顯色，呈陽性，表明，本試紙條對呋喃它酮的檢測限為3 μg/kg；

對呋喃西林的測試結果為：滴試0、1 μg/kg濃度時，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性，當滴試2、4 μg/kg濃度的標準液時試紙條檢測線不顯色，呈陽性，表明，本試紙條對呋喃西林的檢測限為2 μg/kg；

對呋喃妥因的測試結果為：滴試0、1 μg/kg濃度時，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性，當滴試2、4 μg/kg濃度的標準液時試紙條檢測線不顯色，呈陽性，表明，本試紙條對呋喃妥因的檢測限為2 μg/kg。

2.2.2 試紙條假陽性率的測定

取空白飼料（不含有硝基呋喃藥物）樣本50份，將飼料樣本前處理后用試紙條進行檢測，每個樣本重復測定2次，結果有1份試紙條的檢測結果為陽性，試紙條檢測飼料樣本的假陽性率為2%。

2.2.3 試紙條假陰性率的測定

取陽性飼料（呋喃唑酮含量≥5 μg/kg）樣本50份，陽性飼料（呋喃它酮含量≥3 μg/kg）樣本50份，陽性飼料（呋喃西林含量≥2 μg/kg）樣本50份，陽性飼料（呋喃妥因含量≥2 μg/kg）樣本50份，用試紙條進行檢測，每個樣本重復測定2次，結果試紙條的檢測結果均為陰性,試紙條檢測飼料樣本的假陰性率為0。

2.2.4 實際樣本的試紙條檢測結果與高效液相色譜[12]檢測結果的比較

采集50份飼料樣本，每種稱取1 g于離心管中，加50%的甲醇水溶液10 ml，渦動，靜置，取上清液檢測。先用本實驗研制試紙條進行初篩，然后用高效液相色譜法進行復核。試紙條檢測結果表明50份飼料樣本中43份為陰性，其余7份為陽性；試紙條檢測結果和高效液相色譜檢測結果的陽性符合率為100%。

2.2.5 保存性實驗

將制作好的試紙條置于鋁箔袋中，加干燥劑密閉包裝，分別置于4℃、37℃、室溫(20～25 ℃)條件下，其中置于4℃和室溫條件的試紙條每隔7 d取出兩組，置于37℃每天取出兩組,分別檢測陰性飼料樣本和陽性飼料樣本（含有2 μg/kg的呋喃西林）。觀察檢測線的有無，顏色深淺及玻璃纖維素膜上金標抗體的釋放程度，4℃和室溫條件下的保存試驗持續3個月，37℃條件下保存試驗持續7 d。確定試紙條的保存條件是置于鋁箔袋中抽真空、加干燥劑室溫密閉保存。

3 小結

硝基呋喃類藥物作為抗生素，其殘留通過食物鏈嚴重危害人體健康，各國都對其殘留做出限量要求。本研究制備了硝基呋喃類藥物單克隆抗體，建立了硝基呋喃類藥物膠體金免疫層析檢測試紙條方法。結果表明，該試紙條檢測方法對飼料中呋喃唑酮的檢測限為5 μg/kg，對飼料中呋喃它酮的檢測限為3 μg/kg，對飼料中呋喃西林的檢測限為2 μg/kg，對飼料中呋喃妥因的檢測限為2 μg/kg；本方法試紙條對飼料樣本檢測的假陽性率為2%，假陰性率為0；與儀器方法檢測結果的陽性復核率為100%；單個樣本的檢測時間僅需10 min。本試紙條產品，檢測時不需要復雜的儀器設備，樣本前處理簡單，檢測成本低，檢測效率高，適合于大規模的現場篩查。

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