利用體外培養法測定精補料的營養價值

艷 城 內蒙古農業大學，內蒙古呼和浩特 010020

通過飼料營養價值評定，可以了解和掌握各種動物對飼料養分的利用情況、需要量及其變化規律，為科學飼養奠定理論基礎。目前，評定飼料營養價值的方法主要有概略養分分析法、體內法和體外法。概略養分分析法是評定飼料營養價值的一種常用方法，如總能、總磷、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維等的測定方法。但利用此法所得的飼料養分與動物消化吸收的養分之間存在很大差異，不足以準確地反映飼料的實際營養價值。體內法是評定飼料在瘤胃內降解率的直接方法。體內法測定動物對飼料的采食量、消化率和利用率，并以此評估飼料的營養價值。然而，應用傳統的體內法來檢測飼料的消化率，實驗周期長、費用高，并且需要大量的樣品，不便于大規模進行。另外，由于實驗動物個體間差異較大，實驗結果可重復性較差，不利于測定方法的標準化。隨著動物消化生理研究的深入和技術手段的創新，利用動物體外消化模擬技術來研究飼料的營養價值已成為可能。因此人們建立了體外法來研究飼料的營養價值。體外法是借助生物學方法體外模擬動物消化過程估測飼料消化率。體外試驗技術因其操作方法較易掌握、實驗周期短、重復性好等特點得到了廣泛的應用。在反芻動物飼料營養價值評定中采用的體外方法較典型的有：Tilley和Terry(1963)建立的兩步法 （兩級離體法）、體外產氣法（HFT技術）和體外連續培養法。

目前，應用最廣泛的是Tilly和Terry（1963）提出的一步法和此后改進的兩步法（即兩級離體法）。它是將瘤胃液過濾后與待測飼料在厭氧環境、適宜的溫度（38℃～39℃）和 pH（6.7～6.9）等條件下共同培養48h后，再用瘤胃蛋白酶（pH大約為2）培養48h，以模擬飼料在瘤胃、真胃和部分小腸的消化過程。根據發酵培養管內殘留物的分析結果，估測飼料消化率。測定飼料營養成分大多采用差值法。體外產氣法是Raab,L.等（1983）和德國荷恩海姆大學動物營養研究所Menke K.H等人建立的，是目前采用最多的用來評價飼料營養價值的方法之一。國外文獻多稱該方法為HFT技術。此方法是基于飼料樣品在體外用瘤胃液消化所產生氣體的比率來估計飼料消化率。飼料樣品的活體外經瘤胃微生物發酵所產生的氣體（C O2、CH4、H2）為微生物的代謝產物，因此，在一定的代謝途徑下，可以利用氣體產生的數量或速度反映營養物質被瘤胃微生物發酵的程度和速度。消化率不同的各種飼料，在相應的時間內（一般為24h）產氣量與產氣率不同。

本文針對利用兩步法和體外產氣法 （HFT技術）進行飼料的營養價值評定做進一步的概述，即采用瘤胃液對飼料進行體外培養，以達到近似于瘤胃內發酵環境來評定飼料的營養價值。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

2011年3 月至2011年5月，內蒙古農牧業科學院動物營養所。

1.2 試驗動物

營養所試驗基地的（具瘤胃瘺管的）絨山羊2只。

1.3 試驗材料

市售精補顆粒料，羊草由動物營養所試驗基地提供，試驗日糧為按表1配制的全混日糧。

瘤胃液采自裝有永久性瘤胃瘺管并飼喂精粗料比為40∶60飼糧的內蒙古白絨山羊。

實驗試劑：緩沖液、胃蛋白酶溶液；培養液；0.2M鹽酸、工作液、A液、B液。

1.4 試驗方法

1.4.1 概略養分分析試驗方法

表1 全混日糧的配方

營養成分測定方法參照楊勝(1999)的《飼料分析及飼料質量檢測技術》。

干物質（DM）：用105℃干燥法測定。

粗脂肪（EE）：采用 SZF-06A脂肪測定儀，將烘干后的樣品用濾紙包裹后由玻璃入口放入，再加乙醚，使之反應。4h后取出樣品烘干稱重，計算出脂肪含量。

粗灰分(Ash)：茂福爐中550℃～600℃下灰化測定。取烘干后的樣品移入坩鍋碳化、灰化(600℃)至恒重；測定每批樣品的粗灰分重量。

粗蛋白(CP)：用凱氏半微量定氮法測定。取烘干后的樣品移入消化管進行消化，每份樣品中分別加入適量的催化劑和15m l的H2SO4后開始消化。消化完畢后，測定每批樣品的粗蛋白含量。

中性洗滌纖維(NDF)：取烘干后的樣品移入袋后按Van soest中性洗滌劑法測定。

非纖維性碳水化合物NFC%=100-(NDF%+CP%+Fat%+Ash%)

1.4.2 兩極離體試驗方法

首先在厭氧、39℃條件下,用瘤胃液的稀釋液消化1.5g底物樣品 （稱取樣品1.5g，放入培養瓶中，每管加入120m L的緩沖液混勻，通入CO2，直到其處于飽和狀態。放入培養箱中，使其溫度達到38℃，然后加入30m L瘤胃液，測定pH并通入CO2，，達到飽和。pH 應保持在 6.7～6.9，利用 1mol/L的NaCO3來加以調整）放入培養箱中培養48h,每天搖動2～3次。在培養開始后6小時和24小時測定pH值并進行調整。然后加入1m L 5%HgCl2,2m L1moL/L的NaCO3以抑制微生物的活動，促進沉淀，棄上清液。然后加入胃蛋白酶150m L在39℃、酸性條件（pH應在1.5左右）下,消化48h。培養結束后,測定殘渣中的DM、CP和NDF含量,計算出DMD、CPD和NDFD含量。

1.4.3 體外產氣試驗方法

產氣量的測定：同時進行3個重復的培養,將0.4000g待測樣品干物質置于特制的150m L酸奶瓶中,用60m L瘤胃稀釋液(20m l瘤胃液+40m l培養液)消化。 記錄 1、2、3、6、8、12、24、36、48 各時間點的產氣量。采用Groot等(1996)描述的多相組合模擬模型gas(ml)=a1/(1+(k1/t))c1+……+an/(1+(kn/t))cn計算動態消化產氣參數。式中：Y為a代表每一飼料組分理論上的最大產氣量(ml)；k為對應飼料組分達到最大產氣量一半時所需時間 ,h；而c是決定曲線形狀的參數；t為培養時間(h)。從產氣開始后，按照時間點記錄產氣量，每次記錄完進行放氣，使注射器的刻度為零，等下一次記錄完畢后又返回到零刻度。由于前幾個小時產氣較多，記錄時間稍微密集一點，以后間隔的時間稍長一點，以此減少試驗誤差。

活體外pH、NH3-N測定：在39℃、厭氧條件下,將0.2000g待測樣品干物質置于特制的150m L酸奶瓶中,用30m L瘤胃稀釋液 (10m l瘤胃+20m l培養液)消化。每個培養設3個重復，待培養至24 h時立即測定發酵液pH（采用上海雷磁儀器廠產PHS-3B型高精度酸度計測定）,氨態氮含量測定參照馮宗慈等（1993）方法。

NH3-N測定方法為：依次量取工作液0、1、2、4、6m l置于5個編號的50m l容量瓶內，接著依次加入蒸餾水 10、9、8、6、4m l， 使之成為 10m l。 再用0.2M鹽酸定容到刻度處，此系列標準溶液每100m l的含氮量依次為 0、0.2、0.4、0.8、1.2。 準確量取各標準溶液0.4m l分別置于5個10m l試管內，各管內依次加入A液2m l和B液2m l搖勻，靜置10分鐘后，用722分光光度計于波長700nm處比色，0.5cm的比色皿，用蒸餾水的0號試管作為空白對照，測定各溶液消光值(0號標液保存，測樣品時調零點用)。用消光值作為自變量、溶液含N量作為從變量導出回歸方程式。做出標線后，從培養液中取10m l于3500～4000r/m in下離心10m in，量取0.5m l上清液置于15m l試管內，再加入9.5m l 0.2M鹽酸至10m l搖勻(稀釋倍數為20)，比色操作同上所述。把測得的消光值代入回歸公式，算得的結果再乘以樣品的稀釋倍數即為原樣品中的氨氮含量。

1.5 試驗目的

本試驗采用的日糧1為羔羊開口料，日糧2為羔羊育肥料。

在飼養羔羊的過程中，羔羊提前補飼可以促進前胃的發育，增加羔羊營養來源，提高羔羊安全越冬能力，一般羔羊從10日齡開始到斷奶前都需進行補飼。補飼前期用開口料飼喂槽羔羊。這個階段是羔羊由吃母乳逐漸到采食草料的過渡時期，從開始補飼到6周齡以母乳為主，補飼開口料為輔。6周齡到斷奶期間以補飼育肥料為主，母乳為輔，在補飼中逐漸增加優質干草與精補料的數量，減少母乳的飼喂量。

羔羊開口料和羔羊育肥料都要求具有全面的營養以及在消化道內易消化降解，因此本試驗利用概略養分分析、兩級離體和體外產氣試驗等來綜合評價兩種日糧的營養價值。

2 結果與分析

2.1 概略養分分析結果

表2 不同比例全混日糧營養成分

圖1 不同比例全混日糧營養成分

從圖1可以看出兩種不同比例全混日糧的營養成分，其中1號樣品中的三大營養物質粗蛋白、粗脂肪和碳水化合物的含量較高。

2.2 兩級離體實驗結果

表2 全混日糧DM消化率、CP消化率、NDF消化率

圖2 全混日糧DM消化率、CP消化率、NDF消化率

由上圖可以看出，不同比例全混日糧的消化率均為1號樣品的高。

2.3 體外產氣實驗結果

表3 不同比例全混日糧體外產氣量

圖3 不同比例全混日糧體外產氣量

由圖3可知，前3h兩個樣品的差距不大，3～24h內1號樣品的產氣量明顯高于2號樣品的產氣量，而24h后產氣量極少。

表4 不同比例全混日糧產氣曲線

圖4 不同比例全混日糧產氣曲線

由圖4可以看出，兩種日糧最大產氣量分別為91.194（ml）、92.737（ml）。從不同發酵參數之間的相關關系可以看出,在發酵時間比較短的情況下,理論最大產氣量受產氣速率及延滯時間的影響。而產氣速率與主要營養成分的含量之間存在著極顯著的相關性。

圖5 NH3-N標線

由圖5可知，標線y=1.094x-0.022（y：濃度，x：吸光度，原樣稀釋倍數為20倍）。

表5 NH3-N的濃度

由表5可以看出，1號樣品的氨氮濃度明顯高于2號樣品。

表6 pH值的測定

由表6可以看出，兩個樣品間pH值差距不大，和絨山羊瘤胃內環境相差不大，均處于正常生理范圍(pH值5.5～7.5)內,不會影響瘤胃的發酵功能。

3 討論與結論

3.1 討論

（1）不同精粗比日糧對消化率的影響

兩級離體技術測定的結果（表2）顯示，不同精粗比的飼料其消化率也不同，相對而言1號精補料的消化率比2號精補料的消化率高一些，差異不顯著。其粗蛋白的消化率最明顯，NDF在瘤胃的消化率是1號樣品高于2號樣品。這說明，消化率受粗蛋白質的影響，飼料中粗蛋白含量越高其消化率越高。高含量的NDF會降低微生物對全混日糧的降解速率,從而延緩發酵的啟動。然而，當日糧中非結構性碳水化合物或易發酵物質的含量較高時,微生物會利用降解產物迅速繁殖,從而提高消化率。

（2）不同精粗比日糧對產氣量的影響

一般來說，產氣量是反映底物中碳水化合物組分被瘤胃微生物利用程度的標志。體外產氣法發酵后的主要產物為CO2、CH4和VFA。然而,VFA在被緩沖劑中和后也會產生少量的氣體。因此,可以說產氣量反映了底物發酵。產氣量多，說明底物中碳水化合物組分含量高或被利用的比例大；產氣量少則反之。然而，在底物粗蛋白含量不同的條件下，瘤胃微生物產氣量的高低不能完全反映底物被利用的程度。Picard等曾報道，當底物蛋白質含量高時，底物的DMD明顯提高，但底物的發酵產氣量明顯減少。

本試驗利用體外產氣法研究了2種不同全混日糧的營養價值。從圖中可以看出，前3h 1號日糧和2號日糧的產氣量差距不太明顯，而3～24h的產氣量1號日糧明顯高于2號日糧，24h以后2號日糧的產氣量比1號日糧的高。總的來說，1號日糧的產氣量均高于2號日糧。在瘤胃中，2種不同比例全混日糧發酵參數不同，可以說，在瘤胃中被消化吸收的程度不同。精飼料本身較易被動物的瘤胃液消化。不同比例全混日糧的最大產氣量為91.194、92.737。從不同發酵參數之間的相關關系可以看出,在發酵時間比較短的情況下,理論最大產氣量受產氣速率及延滯時間的影響。而產氣速率與主要營養成分的含量之間存在著極顯著的相關性,由此可以推斷其通過營養成分對底物發酵速率起到促進或抑制作用。

（3）不同精粗比日糧對瘤胃氨氮濃度的影響

NH3-N是飼料蛋白質、肽、氨基酸、氨化物、尿素和其它非蛋白質氮化合物分解的終產物,同時又是微生物合成菌體蛋白的原料,其濃度反映的是飼料中蛋白質的降解情況。瘤胃NH3-N濃度在一定程度上反了特定日糧組成下蛋白降解與合成間所達到的平衡狀態。由表4可知兩試驗組氨氮濃度范圍是 6.56～25.33mg/100m L，處于已報道的最佳NH3-N濃度 (6.3～27.5 mg/100m l)范圍之內（Murphy 等，1987；Ortega 等，1979）。 所以，本試驗中兩種精粗比日糧均使瘤胃發酵產生了適當的NH3-N濃度。本試驗表明，添加不同日糧會直接影響飼料蛋白質在瘤胃內的降解。

（4）不同精粗比日糧對瘤胃pH值的影響

瘤胃碳水化合物發酵的主要產物是乙酸、丙酸和丁酸等VFA，它們是反芻動物主要的能量來源及合成乳脂和體脂的原料。VFA濃度在很大程度上影響瘤胃的pH值，而反過來瘤胃pH值對瘤胃微生物群落也有重要影響。pH值是反應瘤胃發酵情況的發酵水平的綜合指標，在1和2試驗組中，瘤胃pH值的范圍是6.43～6.52，處于Murphy等(1987)所報道的正常范圍內。表明兩組日糧條件下瘤胃均處于正常發酵狀態。正常的瘤胃發酵pH值范圍,驗證了試驗是在正常的發酵環境中進行的,同時也證明了試驗數據的可靠性。

3.2 結論

從結果可知，1號樣品的消化率均高于2號樣品，而體外產氣量也表明1號樣品的產氣量比2號的高。在pH值正常的發酵情況下氨氮濃度也是1號樣品的高于2號樣品。可以說不同比例的全混日糧在瘤胃中的消化和利用率不同，營養價值也有所不同。

然而，體外培養技術廣泛地應用于反芻動物營養研究,得益于其技術簡便、費用低,以及相應測定裝置的發展。但是，目前仍缺少對不同實驗室之間的試驗比較,各個實驗室之間的數據往往無法比較。同時,各個實驗室采用的具體的技術細節和裝置不同,難以制定統一的標準化程序。此外,作為一種動物消化模擬技術關鍵在于與體內環境相似,所以本實驗只給飼料營養價值評定中提供理論依據。

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