“理囊散”中揮發油提取工藝及促孕活性研究

曾云軍 ，李炳奇 ，陳韓英 ，劉 紅

（1.石河子大學化學化工學院/新疆兵團化工綠色過程重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，新疆石河子 832003；2.石河子大學藥學院，新疆石河子 832003；3.石河子大學理學院，新疆石河子 832003）

治療奶牛不孕的中藥復方“理囊散”，由香附子、莪術、三棱等十余味中藥組成，主要用于治療卵巢囊腫和排卵延遲等原因造成的奶牛不孕癥，該復方作用效果持久，副作用小，具有促孕作用[1]，其中揮發油是其主要活性成分之一。

目前，揮發油的提取方法一般有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、超臨界流體萃取法，有機溶劑萃取法容易引入新的雜質，造成有機溶劑殘留[2]，超臨界流體萃取法的成本較高且不適用于工廠生產[3]，而水蒸氣蒸餾法操作簡便，基本無污染，是《中國藥典》中揮發油含量測定方法。本實驗以揮發油得率為考察指標，采用水蒸氣蒸餾法，單因素、正交設計考察了提取時間、加水量和浸泡時間對理囊散揮發油提取率的影響，確定了水蒸氣蒸餾法提取理囊散揮發油的最佳提取工藝。考察了理囊散揮發油對21日齡雌性昆明種小鼠子宮系數和卵巢卵泡發育的影響。以期為理囊散開發成新劑型提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

揮發油提取器（烏魯木齊市醫藥公司）；KMD型電熱套（武漢精華科技有限公司）；電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；AR-2140型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司制造）；顯微鏡（Olympus）。

苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業股份有限公司，每支 1mL，含雌二醇 2mg，批號：110514，用甘油稀釋成50 g·mL-1)；21日雌性昆明種小鼠（由石河子大學實驗動物中心提供，分籠飼養，自由飲水和進食）；中藥復方由石河子大學動物科技學院提供；蒸餾水（自制）。

1.2 方法

1.2.1 揮發油的提取

準確稱取100 g中藥復方粉末，按照《中國藥典》2010版一部“附錄”X D揮發油測定法提取揮發油[4]，冷卻后讀取其體積數，再按下式計算揮發油得率。

1.2.2 揮發油提取的單因素實驗

預實驗發現，揮發油得率與加水倍數、浸泡時間、提取時間有關系，因此先通過單因素實驗考察提取理囊散揮發油的最佳工藝條件范圍。

（1）對加水倍數的考察 按照“1.2.1”項下方法，分別加入 8、10、12、14、16倍蒸餾水，浸泡 2h，提取3h，測定揮發油提取量并計算揮發油得率，以確定最佳加水倍數范圍。

（2）對浸泡時間的考察 按照“1.2.1”項下方法，加入12倍蒸餾水，分別浸泡0h、1h、2h、3h、4h，提取3h，測定揮發油提取量并計算揮發油得率，以確定最佳浸泡時間范圍。

（3）對蒸餾時間的考察 按照“2.1”項下方法，加入12倍蒸餾水，浸泡2h，分別提取0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，測定揮發油提取量并計算揮發油得率，以確定最佳提取時間范圍。

1.2.3 正交實驗

根據單因素實驗結果，選取影響揮發油提取效果的加水倍數（A）、浸泡時間（B）、提取時間（C）作為考察因素，每一個因素設3個水平，以揮發油得率為考察指標，選用L9（34）正交表，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

1.2.4 揮發油成分的促孕活性研究

準確稱取“理囊散”中藥粉末適量，按正交試驗選出的最優工藝提取揮發油，收集揮發油待用。

（1）揮發油對小鼠子宮系數的影響試驗 取雌性小鼠50只，體重9-12 g，隨機分為5組，分別為揮發油高、中、低劑量組（6 g/kg、4 g/kg、2 g/kg)，空白對照組及陽性對照組。揮發油組灌服給藥，每天1次，連續給藥7 d；陽性對照組從第4天開始腹腔注射雌二醇，0.5mg/kg，連續給藥7 d；空白對照組給予等體積蒸餾水。各組小鼠于末次給藥后24小時頸椎脫臼處死，剖開腹腔，摘取子宮，迅速稱子宮濕重，計算子宮系數[5]。

（2）揮發油對小白鼠卵巢的影響試驗 取雌性小鼠50只，體重9-12 g，隨機分為5組，分別為揮發油高、中、低劑量組（6 g/kg、4 g/kg、2 g/kg)，空白對照組及陽性對照組。揮發油組灌服給藥，每天1次，第4天劑量加倍，連續給藥7 d；陽性對照組從第4天開始腹腔注射雌二醇，0.5mg/kg，連續給藥7 d；空白對照組給予等體積蒸餾水；各組小鼠于末次給藥后24小時頸椎脫臼處死，剖開腹腔，立即摘取卵巢，投入10%中性福爾馬林中固定48 h，常規石蠟切片，蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察卵泡直徑并進行分類計數[6]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 對加水倍數的考察

圖1 加水倍數對揮發油得率的影響

由圖1可知，加水量在12倍時理囊散揮發油的收率為最高，可以認為加水量過多導致精油在水中的溶解量也隨之增大，影響提取效果，必將降低出油率；反之，水散作用進行不徹底，也將降低出油率，故選擇加水量為12倍左右進行正交。

2.1.2 對浸泡時間的考察

圖2 浸泡時間對揮發油得率的影響

由圖2實驗結果可得，理囊散揮發油提取率隨著浸泡時間的延長而增大，在3h后基本不再增加，浸泡理論認為浸泡可使植物細胞間隙變大，組織細胞充分膨脹，加速細胞內、外液動態交換而有利于揮發油的提取[7]。因此，可以認為理囊散浸泡3h組織已經充分膨脹，本著工業生產節約時間原則，浸泡時間選擇1、2、3h進行正交實驗。

2.1.3 對蒸餾時間的考察

圖3 蒸餾時間對揮發油得率的影響

觀察圖3提取過程可以看出，蒸餾2h前揮發油蒸餾出的比較多，6h后隨著蒸餾的增加，蒸餾出來的揮發油量增加緩慢。這是由于隨時間延長，料液中油類組分減少，因此揮發油蒸餾出的量減少，故選擇2、4、6h進行正交實驗。

2.2 正交實驗

表2 L9（34）正交設計表及結果

表3 方差分析

由直觀分析（表2）可知，各因素影響的主次順序為C>B>A，由方差分析（表3）可得C因素具有顯著性影響(P<0.05)，最優水平為A2B3C3，即加水量12倍，浸泡時間3h，提取6h。

2.3 驗證實驗

為確證該工藝的正確和穩定性，考慮到實驗誤差和實際生產，在上述正交實驗的基礎上，按優選的最佳工藝條件，進行了重復驗證實驗。即稱取中藥復方粉末100 g，按正交實驗結果重復3次，揮發油得率分別為0.54%、0.53%、0.54%，均高于正交實驗中的各組實驗值。可見，在最佳工藝條件下進行理囊散揮發油的提取，不但揮發油得量高，而且重復性較好。

2.4 揮發油成分的促孕活性研究

2.4.1 各組對雌性小鼠子宮系數的影響 結果見表4。

表4 各組對雌性小鼠子宮系數的影響

由表4可知，與空白對照組相比，揮發油和理囊散高、中、低劑量組子宮系數明顯增加（P<0.05），用藥效果與藥物劑量呈正相關，但都低于陽性對照組，說明揮發油組能夠提高小鼠子宮系數。

表5 小鼠卵巢中各種類型卵泡百分比及最大卵泡直徑

2.4.2 小鼠卵巢中各種類型卵泡百分比及最大卵泡直徑 結果見表5。

從表5可以看出，與空白對照組相比，揮發油高、中、低3個劑量組中大型卵泡的百分比均顯著高于空白對照組(P<0.05)；而中型卵泡和小型卵泡的百分比均顯著低于空白對照組(P<0.05)；揮發油中、低劑量組的最大卵泡直徑對空白組沒有統計學意義。

3 討論

揮發油為理囊散的主要有效成分之一，采用水蒸氣法提取揮發油，方法經典成熟，不易造成污染，適用于工業化生產。提取過程中發現有些藥材易浮于水面上，因此可在浸泡過程中不斷攪拌，使藥材組織細胞充分膨脹。驗證實驗表明，理囊散揮發油的提取工藝是合理、可行的。

小鼠子宮增重法是一種最常用的評價雌激素作用的方法，其原理主要是子宮組織含有大量的雌激素受體，雌激素或具有雌激素活性的化合物通過與受體結合，可誘發細胞內的反應，使子宮組織的誘導蛋白含量增加，表現為子宮組織增生變厚而使子宮增重[8,9]。本實驗結果表明，“理囊散”揮發油能明顯使幼鼠子宮系數增加(P<0.05)，且成劑量依賴性。提示“理囊散”揮發油具有促進小鼠子宮發育的作用。

卵泡成熟的程度是判斷卵巢發育的程度的重要依據之一。本實驗的小鼠卵巢變化結果表明，揮發油組發生了類似于雌二醇組的變化，其顯著特點是成熟卵泡比例，卵泡直徑均顯著高于陰性對照組，提示理囊散揮發油能促進卵巢發育，使其提前出現性成熟后的形態學特征。

綜述所述，本實驗確認了“理囊散”中揮發油具有明顯的促孕活性，為理囊散開發成新劑型提供理論支持。

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