中藥復方對嗜水氣單胞菌的抗菌試驗

楊仕群，陽 剛

(四川省宜賓職業技術學院，四川宜賓 644003)

隨著水產養殖業的快速發展，高密度養殖、水質的惡化使養殖的水產動物疾病頻發，抗生素使用范圍和用量不斷增加，不僅污染了水環境，而且對人類的健康造成了威脅。

氣單胞菌在細菌分類上屬于弧菌科氣單胞菌屬，嗜水單胞菌是其中一種，廣泛分布于池水、淤泥等自然環境[1-2]。嗜水氣單胞菌可引起淡水魚類及蛙、鱉等多種水產動物的敗血癥和人類腹瀉，往往給淡水養殖業造成嚴重的經濟損失。目前，其主要的治療方法為應用各類抗生素，但隨著長時間的應用抗生素，導致水產品藥物殘留及病原菌的耐藥性逐漸加強的問題日益突出。而中草藥是天然藥物，因其具有無抗藥性、無殘留、無副作用、無環境污染、不引發藥源性疾病，且抑菌殺菌效果明顯，備受人們關注[3-5]。本研究在單味中草藥抑菌的基礎上，初步篩選了12種中草藥組成5個復方，旨在為草魚細菌性敗血病的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病原菌 病原菌是從患典型細菌性敗血癥的草魚肝臟中分離的，經純化并測定其毒力后由宜賓職業技術學院微生物實驗室鑒定為嗜水氣單胞菌。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0g，蛋白胨 10.0g，氯化鈉 5.0g，瓊脂 20g。

1.1.3 中藥 實驗選用文獻已報道或臨床應用的水產常用中草藥，由不同單方藥物配組構成多個復方，主要成分為五倍子、烏梅、黃連、黃芩、訶子等。試驗用藥購于宜賓市醫藥公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備 將中藥先在干燥箱內(40℃)烘干，用粉碎機打成粉狀，按設計復方(編號：A、B、C、D、E)稱取粉狀原料，混合均勻備用。稱取復方中草藥各20g，分別放至燒杯加蒸餾水煎煮三次，每次30min，用精密濾紙過濾去渣，將藥液濃縮至1：20濃度，抽濾除菌后作為實驗母液。再用無菌生理鹽水將藥液稀釋至設計的濃度(參照各藥的MBC)。

1.2.2 菌懸液的制備 少量的液體培養基接種嗜水氣單胞菌后震蕩培養12～16h。菌液培養好后用液體培養基稀釋到合適濃度。本實驗中菌液濃度為1×107個／mL。

1.2.3 復方中草藥抑菌定性試驗 固體培養基平板直徑約90.0mm，培養基厚度約3.6mm，在平板上均勻涂布100ul嗜水氣單胞菌懸液；待菌干后，分別貼上用直徑為6.0mm無菌濾紙片沾各復方藥母液后制成的紙片，并設無菌生理鹽水為對照，放在恒溫箱內(28℃)培養24 h后，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈。

1.2.4 復方中草藥抑菌MIC及MBC的測定 參照陳學年[6]等的試驗方法進行，即采用96孔板微量雙倍稀釋法(共8排，每排12個孔，孔底呈U形，每孔容量為0.25ml，各孔先加50ul普通肉湯培養液，然后用微量移液器吸取50ul中藥母液至第1個孔，混合均勻后又從第1孔吸取50ul至第2孔，依次類推雙倍稀釋至第11孔，最后從第11孔吸取50ul棄去，第l2孔不加藥液作為對照)，將各復方藥稀釋成不同濃度梯度，接種嗜水氣單胞菌(50ul)后放在恒溫箱內(28℃)培養24h，觀察記錄 (黑背景下觀察剛澄清透明者)最低抑菌濃度(MIC)，在此基礎上再培養24h觀察記錄，確定最低殺菌濃度(MBC)。

2 結果

2.1 復方中草藥抑菌定性實驗結果 用于試驗的五個復方中，A對嗜水氣單胞菌有很強的抗菌作用。C、D有中等程度的抗菌作用，其余復方抗菌作用較弱。結果見表1。

表1 五種復方中草藥抑菌結果

2.2 復方中草藥抑菌MIC及MBC測定結果 對A、B、C、D、E 五組中草藥的對嗜水氣單胞菌的MIC及MBC分別進行測定，結果見表2。

表2 五種復方中草藥MIC及MBC測定結果

表2結果顯示，A、B、C、D、E 5組復方中草藥對嗜水氣單胞菌的MIC分別為25mg/L、98mg/L、49mg/L、49mg/L、195mg/L；MBC分別為 49mg/L、195mg/L、98mg/L、98mg/L、391mg/L。

3 討論

本試驗5組復方中草藥對嗜水氣單胞菌進行體外抗菌試驗研究，發現A、C、D三組復方中草藥對嗜水氣單胞菌的抑菌和殺菌效果最好，這與陳學年等[6]的研究結果相似。該三組復方中草藥主要成分為五倍子、黃連、黃芩等，主要以清熱解毒功效為主，性寒；而嗜水氣單胞菌引起的細菌性敗血癥多發生在高溫季節，屬于“熱性病”，“熱者寒之”和“熱病寒藥”的中醫辨證治療理論在此得到驗證。

[1]張海賓，楊桂芳.12種中草藥對嗜水氣單胞菌殺傷能力的研究[J].水產科學，2006，25（1）：16-18..

[2]曹紅峰，宋靖芳，李國慶等.中草藥對嗜水氣單胞菌ST-3-3抑菌作用的研究[J].中醫藥導報，2007，13（5）：86-88.

[3]王文博，汪建國，李愛華，等.中草藥應用于水產養殖的研究概況[J].中國水產，2006，7：60-61.

[4]向梟，周興華.中草藥添加劑在水產養殖上的應用[J].糧食與飼料工業，2000，3：27-29.

[5]曹紅峰，黃文芳，宋靖芳.中草藥防治魚病研究進展[J].海洋科學，2006,30(4):83-87.

[6]陳學年，郭玉娟.中草藥防治鯽魚敗血癥試驗[J].淡水漁業，2001，31（1）：43-45.