豬A組輪狀病毒pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的構建及表達

葉麗萍，王春玲，王春鳳

（1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2.吉林省永吉縣畜牧局黃榆鄉畜牧站，吉林 永吉 132223）

乳酸菌為人及動物體內正常菌群的重要成員，主要定植在黏膜表面，刺激機體的免疫系統對調整菌群平衡起重要作用。乳酸菌能刺激機體SIgA的細胞增殖，使SIgA水平上升，從而使機體對RV產生免疫應答，緩和RV引起的腹瀉。乳酸菌已作為一種新型表達系統成功表達了多種外源基因，但由于乳酸菌屬革蘭陽性菌，應用氯化鈣轉化法所獲得的轉化子較少，轉化效率較低，而用電轉化方法可使細菌轉化效率達到109～1010轉化子／μg閉環DNA［1］。本文以嗜酸乳桿菌作為受體菌株，將豬源A組輪狀病毒pW425et-Vp4重組質粒電轉化入嗜酸乳桿菌，對影響電轉化效率的各因素進行研究，確立提高轉化效率的最佳條件，并對pW425et-Vp4乳酸菌進行反應原性分析，為豬源A組輪狀病毒Vp4基因工程乳酸菌疫苗的大量制備及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒 嗜酸乳桿菌，為本實驗室保存；豬源A組輪狀病毒pW425et-Vp4重組質粒，為大腸桿菌-乳酸菌穿梭質粒由本人構建。

1.2 試劑 MRS液體培養基用冰醋酸調pH值至6.0～6.2，115℃高壓滅菌20min；取100mL MRS液體培養基加入2%～3%瓊脂粉，115℃高壓滅菌20min制備 MRS固體培養基；PBS緩沖液用HCl調pH值至7.4，加水定容至1L，高壓滅菌20min，室溫保存；PEB電擊緩沖液115℃高壓滅菌保存。輪狀病毒兔抗豬多克隆抗體由吉林農業大學預防獸醫學實驗室研制保存；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，購自寶生物工程（大連）有限公司；SalⅠ、KpnⅠ、核酸分子量標準為TaKaRa公司產品；瓊脂糖為Spanish公司產品；PVDF轉移膜為Gleman公司產品。

1.3 感受態細胞的制備 MRS培養平板上挑取單個嗜酸乳桿菌菌落接種于5mL MRS液體培養基中，37℃靜置厭氧過夜培養；過夜培養物以2%接種量接入20mL MRS培養液中，同時分別加入1%甘氨酸或0.3mol／L蔗糖或1%甘氨酸+0.3mol／L蔗糖；37℃靜置厭氧培養4h左右，摸索乳酸菌不同生長時期及培養基成分對電轉化效率的影響；將生長到最佳時期的乳酸菌，0℃～／min離心10min收集沉淀；冰冷的PEB電擊緩沖液懸浮沉淀，0℃～／min離心5min洗細胞2次；沉淀懸浮于500 μL冰冷的電擊緩沖液中，備用。

1.4 pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的構建 取5～10μL pW425et-Vp4重組質粒加入到200μL冰冷的乳酸菌感受態中混勻，冰浴5min，移入預冷的電擊杯中（內徑0.2cm），冰上靜止5min，優化電場強度及脈沖時間。根據最適條件釋放脈沖，電擊。將電擊混合物移入新的預冷的Eppendorf管中，冰浴5min，加入500μL含0.3mol／mL蔗糖的MRS培養基，37℃靜置厭氧培養3～4h，取50μL培養物涂布含有紅霉素的MRS平板，37℃靜置厭氧培養48h，計數轉化子數目，每項條件優化做3次重復試驗。

1.5 乳酸菌重組質粒的鑒定與表達 電轉化后的重組質粒單菌落接種入5mL含紅霉素的MRS液體培養基中，37℃靜置厭氧培養12h，按O′Sullivan等［2］的方法進行乳酸菌重組質粒的提取。經PCR、酶切鑒定的陽性質粒的單菌落接種入100mL含紅霉素（100μg／mL）的 MRS液體培養基中，37℃靜置厭氧培養至OD600為0.60～0.80，每隔1h取1次菌液，取至7h。以同樣的方法誘導含空載體pW425et的乳酸菌作對照。將各個時間誘導收獲的菌液OD600均調至0.60～0.80，取菌液1.4mL，1200r／min離心5min，棄上清。沉淀中加入50 μL電泳液，1×SDS上樣緩沖液50μL（其中含1／10的DTT），沸水煮10min，25℃12000r／min離心10min，按《分子克隆實驗指南》第2版方法進行8%SDS-PAGE凝膠電泳及Western-blot分析。

2 結果

2.1 pW425et-Vp4基因工程乳酸菌構建條件的優化

2.1.1 細胞生長時期及培養基成分對轉化效率的影響 固定電場強度為11kV／cm，脈沖時間為3.8 ms，細胞的不同生長時期，培養基的不同成分對重組質粒電轉化效率的影響結果如圖1所示。當感受態細胞的OD600值為0.4時，各試驗組的轉化效率均達到了最高值，之后有所下降，所以感受態的最佳生長時期為0.4。在MRS培養基中加入1%甘氨酸組及加入1%甘氨酸+0.3mol／L蔗糖組的轉化效率較MRS組有所提高，且后者更有利于提高電轉化效率，達3.8×104CFU／μg DNA，但加入0.3 mol／L蔗糖組轉化效率較MRS組無明顯變化。

2.1.2 電場強度對轉化效率的影響 固定脈沖時間為3.8ms，改變電場強度進行重組質粒電轉化，轉化效率隨電場強度的增加而增加，于11kV／cm時達到最大，隨后隨著電場強度的增加轉化效率下降（圖2）。

2.3 脈沖時間對轉化效率的影響 脈沖時間的長短直接影響電轉化效率，脈沖時間太短不能使DNA分子有效進入細胞，而脈沖時間過長，細胞生存率又降低［3］。固定電場強度為11kV／cm，脈沖時間在3.5～3.9ms區間轉化效率較高，且于3.8ms時達到最高，隨后有所下降（圖3）。

2.4 電擊后孵育時間對轉化效率的影響 電擊使細胞膜產生孔洞，所以電擊后細胞要進行一段時間的復蘇使孔洞復原。固定電場強度為11kV／cm，脈沖時間為3.8ms，進行重組質粒的電轉化。電擊后不同的孵育時間對轉化效率的影響結果如圖4所示，細胞復蘇3～4h，才能有較好的轉化效率，4h以后轉化效率提高不明顯。所以試驗選擇復蘇3～4h。

2.5 pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的鑒定與表達

2.5.1 乳酸菌重組質粒的酶切鑒定 將乳酸菌重組質粒提取鑒定疑似含有目的片段的1號菌質粒進行SalⅠ和KpnⅠ酶切鑒定。結果獲得兩條片段，大片段約為～bp，小片段約為～bp，表明疑似菌株中的重組質粒中含有外源基因Vp4，為陽性克隆，見圖5。

圖5 重組質粒酶切鑒定

2.5.2 乳酸菌重組質粒的PCR鑒定 以1號菌的質粒為模板，進行PCR鑒定，擴出與預期大小相符的目的條帶，見圖6。

圖6 重組質粒PCR鑒定

2.5.3 SDS-PAGE分析 分析上述經過鑒定為陽性的克隆菌株1各時間的表達情況。由圖7可見Vp4基因獲得了表達，蛋白質的相對分子量約為87 ku的融合蛋白，與預期Vp4蛋白的分子量一致，而空載體pW425et在乳酸菌受體菌株中則未見該蛋白質表達。

圖7 SDS-PAGE電泳檢測Vp4基因在乳酸菌中的表達產物

2.5.4 Western-blot分析 表達產物經SDSPAGE后，電轉移至PVDF轉移膜上，進行蛋白印跡分析，其結果見圖8。從圖中可見87.0ku處有一條明顯的蛋白印跡帶，說明pW425et-Vp4乳酸菌重組質粒表達蛋白可與豬輪狀病毒多克隆抗體反應。

圖8 重組質粒pW425et-Vp4乳酸菌表達產物的Western-blot分析

3 討論

電轉化（Electro-transformation）是利用瞬間高壓打擊細胞膜，使之形成孔洞，使DNA分子得以進入細胞。電轉化是提高乳酸菌的轉化效率的有效方法，然而影響細菌電轉化效率的因素很多。不同生長時期收獲的細胞、電壓、脈沖時間、電擊后孵育時間都將影響電轉化效率的高低。以嗜酸乳桿菌為豬源A組輪狀病毒pW425et-Vp4重組質粒的受體菌株，對影響電轉化的因素進行了研究，結果表明，當感受態細胞的OD600值于0.4時，在MRS培養基中加入1%甘氨酸+0.3mol／L蔗糖，電場強度為11kV／cm，脈沖時間為3.8ms，電擊后細胞復蘇3～4h時，得到較高的轉化效率，最高可達3.8×104CFU／μg DNA。此外，抗生素濃度、質粒DNA濃度、不同的緩沖液的高低也影響電轉化效率。抗生素濃度過低不能保證轉化子的可靠性起不到篩選作用，而濃度過高則會抑制轉化子的生長。DNA分子太少不足以產生高轉化效率，而濃度過高，細胞能吸收的DNA分子過飽和，反而不利于轉化。試驗結果確定紅霉素的最小抑制濃度為100μg／mL，當pW425et-Vp4重組質粒濃度為200ng／μL時轉化效率最高，達3.1×104CFU／μg DNA。

隨著對乳酸菌的研究不斷深入，作為分子生物學基本手段的轉化技術也將日益受到關注，目前已經在某些乳酸菌中成功表達了一系列的外源蛋白［4-5］。可以說以乳酸菌作為表達外源保護性抗原基因的受體菌株，就可以將乳酸菌的生物學功能和外源功能抗原基因的特異性免疫相結合，所以應用乳酸菌攜帶外源基因作為黏膜免疫的口服疫苗將具有良好的應用前景。pW425et-Vp4乳酸菌陽性克隆經Western-blot分析表明，其蛋白具有與輪狀病毒多克隆抗體的反應原性，這為pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的大量制備及其免疫原性分析奠定了基礎，也將為后續試驗作好充分準備。

［1］Wang C，Zhang C W，Liu H C，et al.Non-fusion and fusion expression ofβ-galactosidase from Lactobacillus bulgaricus in Lactococcus lactis［J］.Biomed Environ Sci，2008，21：389-397.

［2］O’sullivan D J，Klaenhammer T R.Mini-Prop Isolation of High-Quality Plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp［J］.Appl Environ Microbiol，1993，59：2730-2733.

［3］Beasldy S S，Takala T M，Reunanen J，et al.Characterization and electrotransformation of Lactobacillus crispatus isolated from chicken crop and intestine［J］.Poult Sci，2004，83（1）：45-48.

［4］Martin M，Gutierrez J，Criado R，et al.Cloning，production and expression of the bacteriocin enterocin a produced by Enterococcus faecium PLBC21in Lactococcus lactis［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，76：667-675.

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