均勻設計法優選柿葉總黃酮的提取工藝Δ

陳麗，韋敏（1.柳州醫學高等?？茖W校藥學教研室，廣西柳州545005；.柳州市人民醫院藥劑科，廣西柳州 545005）

柿葉為柿樹科柿樹屬植物柿的新鮮或干燥葉，主要有效成分是黃酮類化合物。柿葉黃酮具有顯著的降血壓作用，已用于冠心病、心絞痛的治療，是很有前途的天然降血壓藥[1]。柿葉中的黃酮類化合物主要以苷類形式存在，傳統提取時多采用水、甲醇、乙醇作溶劑，乙酸乙酯作萃取劑，但得率較低。本文用均勻設計法對柿葉黃酮乙醇提取工藝進行改進，為進一步研究和開發柿葉醫藥保健品提供工藝參考。

1 儀器與試藥

722可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；JA1003電子天平（上海天平儀器廠）；RE-52旋轉蒸發儀（上海安亭實驗儀器有限公司）；WBZ-2微波真空干燥機（貴陽新奇微波工業有限責任公司）；離心沉淀機（上海醫用分析儀器廠）；KQ-100DB數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

柿葉（購自廣西柳州城站藥材綜合市場，經中國科學院廣西植物研究所韋發南研究員鑒定為真品）；蘆丁標準品（南京替斯艾么中藥研究所，批號：TCM027-071128，含量：99%）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 柿葉總黃酮的含量測定[2]

2.1.1 標準品溶液的制備 精密稱量105℃下干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2 mg·mL-1的標準品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取各種工藝制備的樣品干燥粉末50 mg，加入50%乙醇定容至100 mL，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）溶解30 min，搖勻，靜置，冷卻至室溫，吸取上清液，即得濃度為0.5 mg·mL-1的供試品溶液。

2.1.3 標準曲線的制備 分別精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標準品溶液，置于10 mL容量瓶中，加50%乙醇至10 mL，分別加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加1%NaOH溶液4 mL，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，在510 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）對檢測濃度（c）進行線性回歸，得回歸方程為c＝0.179 4A－0.002 0（r＝0.998 8）。結果表明，蘆丁檢測濃度在0.020～0.100 mg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.4 樣品含量測定 精密吸取供試品溶液5.0 mL，共5份，分別置于50 mL容量瓶中，按“2.1.2”項下方法操作，得供試品待測液（濃度為0.05 mg·mL-1），分別測定吸光度，根據回歸方程計算柿葉總黃酮的含量。

2.2 水提取法提取柿葉總黃酮[3，4]

干燥柿葉粗粉5 g→100 mL蒸餾水浸泡30 min→90℃提取2 h（2次）→合并濾液→離心（3 000 r·min-1）15 min→抽濾→濾液用微波真空干燥濃縮→石油醚萃取2次→水相用乙酸乙酯萃取2次→乙酸乙酯相減壓濃縮→干燥，即得。

2.3 乙醇提取法提取柿葉總黃酮[4，5]

干燥柿葉粗粉5 g→100 mL70%乙醇浸泡30 min→80℃回流提取2 h（2次）→合并濾液并減壓回收乙醇→離心（3 000 r·min-1）15 min→抽濾→濾液用石油醚萃取2次→水相用乙酸乙酯萃取2次→乙酸乙酯相減壓濃縮→干燥，即得。

2.4 均勻設計法優選工藝

2.4.1 柿葉粉碎度的選擇 取不同粒度干燥柿葉，在乙醇濃度為50%，提取溫度為30℃，超聲時間為30 min的條件下考察粒度（10～40、40～80、80～100目）對柿葉總黃酮含量的影響。結果，3種粒度范圍下的柿葉總黃酮含量分別為43.66%、51.32%、47.48%，故本研究所取藥材為過40～80目的干燥柿葉。

2.4.2 提取方法[6，7]采用堿溶酸沉與超聲波相結合的方法。取過40～80目篩的干燥柿葉5 g，根據表1中各水平加入相應濃度和體積的乙醇，用超聲設備在相應的時間和溫度下提取，濾液用旋轉蒸發儀減壓回收乙醇，濃縮液加20%NaOH調至相應pH值，攪勻，靜置1 h，抽濾，濾液用半倍量的石油醚萃取2次，水相加15%HCl調至相應pH值，攪勻，沉淀0.5 h，離心（3 000 r·min-1）15 min，抽濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并3次乙酸乙酯相，減壓回收乙酸乙酯，最后干燥得總黃酮。

2.4.3 均勻設計及結果分析 根據預試驗選取20%NaOH調pH值（X1）、15%HCl調pH值（X2）、乙醇濃度（X3）、超聲溫度（X4）、超聲時間（X5）、液料比（X6）為考察因素，進行U10×（108）均勻試驗，以柿葉總黃酮含量為評價指標，優選柿葉總黃酮提取工藝。因素水平見表1；均勻試驗結果見表2。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 均勻試驗結果Tab 2 Arrangement and results of uniform design

將表2結果輸入均勻分析軟件，進行多元二次多項逐步回歸，得回歸方程為Y＝9.10E+3－727X1+2.81X2－1.39E－2X3+1.21 E－2X4+8.52 E－3X5－161X6，r＝0.989 9，樣本容量n＝10，顯著性水平α＝0.05，檢驗值Ft＝24.44，臨界值F0.05（6，3）＝8.941，Ft＞F0.05（6，3），回歸方程顯著。剩余標準差s＝1.08。各影響因素的標準回歸系數見表3。

表3 各影響因素的標準回歸系數Tab 3 Standardized regression coefficient of each influencing factors

多元回歸中，標準回歸系數顯示，對柿葉總黃酮提取的影響效應依次為HCl調pH值＞NaOH調pH值＞液料比＞超聲時間＞超聲溫度＞乙醇濃度。對各因素進行顯著性檢驗后得知，乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間對柿葉總黃酮的提取無顯著性影響。依據實際經驗，藥材超聲時間通常在24～40 min能獲得最佳提取率，提取溫度為40～60℃能保護有效成分，故將乙醇濃度定為70%，超聲溫度定為30℃，超聲時間定為32 min。均勻試驗結果顯示，用15%HCl調pH值為6，用20%NaOH調pH值為9.78時總黃酮含量最高，這與預試驗結果相符。但由于實際操作很難將pH值準確調至9.78，故定NaOH調pH值為10。液料比太小，溶液很快達到溶解飽和而不利于收率的提高；液料比過大，對收率沒有較大影響，但溶劑量會大大增加[8]，所以根據回歸方程和實際經驗，將液料比定為11∶1。綜上所述，回歸方程各項取值分別為 X1＝10，X2＝6，X3＝70%，X4＝32 min，X5＝30 ℃，X6＝11∶1。

2.4.4 驗證試驗 按上述優化的工藝制備3批樣品，計算得柿葉總黃酮平均含量為68.77%，與回歸方程預報值（64.1±2.09）%相近，且RSD＝1.64%（n＝3），說明重復性良好，所選工藝可行。

2.5 不同提取方法比較

按“2.2”、“2.3”、“2.4”項下方法分別提取柿葉總黃酮，計算各種方法下總黃酮含量，對3種方法進行比較，結果見表4。

表4 不同提取方法提取柿葉總黃酮效果比較（n＝3）Tab 4 Comparison of the efficacy of different extraction methods in extracting total flavonoids from persimmon leaf（n＝3）

3 討論

柿葉黃酮類化合物在堿性環境中易溶，用20%NaOH調pH值為10是讓盡可能多的黃酮溶解，防止在回收乙醇時黃酮類化合物隨雜質析出而被濾除；用15%HCl調pH值為6的作用是除去雜質的同時讓黃酮類化合物游離出來，以利于乙酸乙酯萃取。結果表明，超聲波與堿溶酸沉相結合的提取方法優于其他傳統方法，得到的總黃酮含量最高。

有資料表明，黃酮類化合物與金屬離子形成的絡合物的穩定性受溫度、光照、pH值等多種因素的影響[9～12]，本研究在試驗過程中亦發現，顯色后放置較長時間吸光度會下降，引起測定結果有偏差。所以，柿葉總黃酮含量測定應在與Al（NO3）3反應后的2 h內進行。

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