復方腦康膠囊對β-淀粉樣肽誘導SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用研究

胡文軍，鄧朝暉，李國鋒（1.南方醫科大學南方醫院藥劑科，廣州510515；.廣州軍區聯勤部藥品儀器檢驗所，廣州 510500）

隨著社會的老齡化，老年人的健康保健問題成為一個社會問題。根據流行病學資料，我國老年癡呆的患病率越來越高，1990年為4.61%，2001年為7.2%。隨著年齡增長患病率逐浙增高，80歲以上的老年人患病率大于20%[1]。我國現有老年人口1.4億，約有600萬老年癡呆患者。老年性癡呆是中樞神經系統退行性疾病，以老年斑和神經纖維纏結為主要病理特征，而老年斑以β-淀粉樣肽（β-peptide，Aβ）沉積為核心，可溶性Aβ對神經元具有毒性作用，在體外可導致神經元凋亡[2]。本研究擬通過觀察復方腦康膠囊水提液對Aβ25-35誘導的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞毒性的保護作用，探討其藥理作用，以期為臨床應用提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KSB-IA型超凈工作臺(天津塵埃凈化設備廠)；MCO-15Ac型CO2培養箱（日本三洋公司)；CKX31型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；LD5-10B型離心機(北京醫用離心機廠)；Σ960型酶標儀（臺灣Metertech Inc公司）。

1.2 試藥

復方腦康膠囊（廣州軍區聯勤部藥品儀器檢驗所，批號：091011），取膠囊內容物用蒸餾水煮沸40 min，將上清液調整為0.5 g（生藥）/mL；作為復方腦康膠囊水提取液，備用；Aβ25-35、MTT、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（北京化工廠，批號：090825）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：090612）；青霉素、鏈霉素（上海奔大生物科技有限公司）。

1.3 細胞株

人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞株由南方醫科大學南方醫院提供。

2 方法[3，4]

2.1 SH-SY5Y細胞的培養

DMEM培養基加體積分數為0.15的胎牛血清、青霉素1×105u·L-1、慶大霉素8×104u·L-1，于5%CO2、37 ℃條件下培養SH-SY5Y細胞。待細胞增長至70%融合時，用含EDTA-2Na（0.1 g·L-1）的0.5 g·L-1胰蛋白酶消化傳代，1∶4分瓶傳代，每3～4 d傳代1次。當細胞用藥物（Aβ25-35、復方腦康膠囊）處理時，換用含體積分數為0.02的胎牛血清的培養基進行培養，每隔2 d換液1次。

2.2 藥物試驗濃度的確定

取復方腦康膠囊水提取液適量，加培養液使藥物濃度分別為 0.062 5、0.125、0.25、0.5、0.725、1.0、2.0、4.0 g·L-1。將SH-SY5Y細胞以每1 mL含2.5×103個的密度接種于96孔板中，每孔體積200 μL，72 h后加上述不同濃度含藥培養液，每組4孔。于接種后第4 天，每孔加MTT（5 g·L-1）20 μL ，37 ℃孵育4 h，吸出培養液，每孔加入DMSO 200 μL，振搖10 min，用酶標儀測定550 nm波長處吸光度（OD），細胞的存活率與其OD值呈正比。結果表明，最適濃度為0.725 g·L-1，因此選取0.725 g·L-1濃度用于以下試驗。復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞存活率的影響見圖1。

圖1 復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞存活率的影響Fig 1 Effect of Compound naokang capsules aqueous extract with different concentrations on metabolic rate of SHSY5Y cells

2.3 LDH漏出率測定

將SH-SY5Y細胞以1×104個的密度接種于24孔板，每孔體積1 mL，72 h后分為對照、Aβ25-35（25 μmol·L-1）和復方腦康膠囊（0.725 g·L－1）+Aβ25-35（25 μmol·L-1）組，每組8孔。于接種后第4天留取各組細胞培養液，按照LDH測定試劑盒所示方法，測定550 nm波長處的OD值，并以此值作為LDH漏出率。

2.4 MTT法測定細胞存活率

將SH-SY5Y細胞以每1 mL 2.5×103個的密度接種于96孔板，每孔體積200 μL，72 h后分為對照、Aβ25-35（25 μmol·L－1）和復方腦康膠囊（0.725 g·L－1）+Aβ25-35（25 μmol·L-1）組，每組8～12孔。于接種后第4天，每孔加MTT（5 g·L－1）20 μL，37 ℃孵育4 h ，吸出培養液，每孔加入DMSO 200 μL，振搖10 min，用酶標儀測定550 nm波長處OD值。

2.5 形態學觀察

將SH-SY5Y細胞接種于35 cm2小皿中，72 h后分為對照、Aβ25-35（25 μmol·L－1）和復方腦康膠囊 0.725 g·L－1+Aβ25-3525 μmol·L－1組。加藥后24 h ，瑞氏染色，每組隨機取70 個細胞，用HPIAS21000高清晰度彩色圖文報告管理系統及醫學影像計算機處理系統測量細胞軸突長度和胞體面積。

2.6 統計學方法

全部數據采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，數據用±s表示，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 LDH漏出率測定結果

細胞受損時LDH釋放于培養上清液中，上清液LDH水平反映出細胞損傷或死亡程度，SH-SY5Y細胞損傷后培養液中的LDH明顯增加。Aβ25-35組LDH漏出率顯著高于對照組（P＜0.01），說明Aβ25-35可致SH-SY5Y細胞損傷；而復方腦康膠囊+Aβ25-35組顯著低于Aβ25-35組（P＜0.01），說明復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞具有很好的保護作用。復方腦康膠囊對SHSY5Y細胞LDH漏出率的影響見表1。

表1 復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞LDH漏出率的影響（±s）Tab 1 Effect of Compound naokang capsules on LDH leakage rate of SH-SY5Y cells（±s）

表1 復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞LDH漏出率的影響（±s）Tab 1 Effect of Compound naokang capsules on LDH leakage rate of SH-SY5Y cells（±s）

與對照組比較：＊P＜0.01；與Aβ25-35組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.Aβ25-35group：#P＜0.01

組別對照組Aβ25-35組復方腦康膠囊+Aβ25-35組LDH漏出率/%789.1±63.5 1 344.2±253.3＊675.7±89.5#

3.2 細胞存活率測定結果

Aβ25-35組OD值顯著低于對照組（P＜0.01），而復方腦康膠囊+Aβ25-35組的OD 值顯著高于Aβ25-35組（P＜0.01），表明Aβ25-35可顯著降低SH-SY5Y細胞的活性，而預先用復方腦康膠囊處理培養基，則可明顯減輕Aβ25-35對細胞造成的損傷。復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞活性的影響見表2。

表2 復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞活性的影響（±s）Tab 2 Effect of Compound naokang capsules on cytoactive of SH-SY5Y cells assayed（±s）

表2 復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞活性的影響（±s）Tab 2 Effect of Compound naokang capsules on cytoactive of SH-SY5Y cells assayed（±s）

與對照組比較：＊P＜0.01；與Aβ25-35組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.Aβ25-35group：#P＜0.01

組別對照組Aβ25-35組復方腦康膠囊+Aβ25-35組OD值0.601±0.005 0.590±0.006＊0.622±0.004#

3.3 形態學觀察結果

Aβ25-35組軸突長度和胞體面積顯著小于對照組（P＜0.01），說明Aβ25-35可致SH-SY5Y細胞損傷；而復方腦康膠囊加Aβ25-35組軸突長度和胞體面積顯著大于Aβ25-35組（P＜0.01），說明復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞具有較好的保護作用。復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞形態學的影響見表3。

表3 復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞的形態學影響（±s）Tab 3 Effect of Compound naokang capsules on morphology of SH-SY5Y cells（±s）

表3 復方腦康膠囊對SH-SY5Y細胞的形態學影響（±s）Tab 3 Effect of Compound naokang capsules on morphology of SH-SY5Y cells（±s）

與對照組比較：＊P＜0.01；與Aβ25-35組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.Aβ25-35group：#P＜0.01

組別對照組Aβ25-35組復方腦康膠囊+Aβ25-35組軸突長度/mm 46.14±9.18 25.28±7.67＊55.31±7.33#胞體面積/μm2 642.42±91.27 487.02±72.41＊709.22±66.45#

4 討論

SH-SY5Y具有神經元的形態特點，能在體外不斷傳代，較原代培養的海馬神經元容易培養，因而被廣泛用于神經學領域的研究。SH-SY5Y細胞利于Aβ在細胞外的培養基中聚合并形成纖維性結構，同時將Aβ攝取入細胞內造成細胞內Aβ堆積在目前常用的細胞系中，并將Aβ攝取入細胞內進一步處理。Aβ與SH-SY5Y細胞間的這種關系為其作為體外介質研究Aβ的神經細胞毒性提供了可能。已有的研究發現，包括Aβ25-35在內的Aβ肽段均可誘導SH-SY5Y細胞出現與大鼠腦神經細胞變性相似的改變。因此，用β淀粉樣蛋白作用于SH-SY5Y細胞制備的老年癡呆模型，是研究老年癡呆較好的細胞模型之一。

本研究結果表明，復方腦康膠囊在體外能促進細胞胞體和軸突的生長，能促進神經元存活信號轉導，降低Aβ25-35誘導的SH-SY5Y神經元毒性。復方腦康膠囊的神經營養作用和神經保護作用可能與促進線粒體代謝和減少細胞損傷有關。

[1]中華醫學會精神病學分會.中國老年期癡呆防治指南[M].北京：人民衛生出版社，2007：15.

[2]蔡 貞，姬志娟，徐艷玲，等.APP17肽對Aβ25-35誘導神經細胞凋亡的保護作用[J].中國藥理學通報，2002，18（1）：31.

[3]張景艷，孟 艷，趙志煒，等.救腦益智膠囊對人神經母細胞瘤株SH-SY5Y生長的影響[J].中國中西醫結合雜志，2002，22（6）：82.

[4]余惠旻，周紅祖.基于細胞凋亡表達的中藥四性模式識別系統研究——西洋參和紅參抗MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡的藥性學對比研究[J].中國藥房，2009，20（18）：1 367.