泄?jié)岢苑娇傸S酮對小鼠腎小管上皮細胞增殖與尿酸吸收的影響Δ

吳新榮，臧路平，劉志剛，孫維峰（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣州 510010）

高尿酸血癥（Hyperuricemia）是指血液中的尿酸濃度高于正常水平的一種機體狀態(tài)，其進一步發(fā)展會導致痛風。痛風是一種關節(jié)炎癥，表現(xiàn)為關節(jié)處或者關節(jié)周圍形成尿酸單鈉結晶，促使急性炎癥的發(fā)作和長期的組織損傷。痛風的長期治療途徑為降低血清和組織中的尿酸濃度。

腎小管上皮細胞（Renal tubular epithelial cells，RTECs）上固定的各種轉運體負責腎臟物質(zhì)的轉運，其中尿酸在腎臟中的重吸收作用主要依賴于近端小管上皮細胞膜上表達的尿酸鹽陰離子轉運體（URAT1）[1]。

泄?jié)岢苑绞嵌嗄陙砼R床治療高尿酸血癥的經(jīng)驗方，臨床試驗表明，該處方對高尿酸血癥有良好的治療作用[2]。為進一步明確該處方中的主要活性成分，本課題組對其有效部位進行了分離[3]。總黃酮是在泄?jié)岢苑街刑崛〕龅挠行Р课恢唬延形墨I報道黃酮類化合物對尿酸吸收的影響[4]。本文在此研究基礎上，探討泄?jié)岢苑娇傸S酮體外刺激小鼠RTECs對其尿酸吸收功能的影響，為該藥降尿酸機制的研究和新藥的開發(fā)提供新的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超凈工作臺（江蘇蘇凈集團有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司）；CKX41熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；68酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

泄?jié)岢苑筋w粒（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，批號：101118）；DMEM/F12培養(yǎng)基、D-Hanks、胎牛血清（美國Hyclone公司）；人轉鐵蛋白、牛胰島素、表皮生長因子、percoll細胞分離液、尿酸、尿酸檢測試劑盒、MTT（美國Sigma公司）；I型膠原酶（美國Gibco公司）；青霉素（0.48 g∶80萬u）、鏈霉素（0.96 g∶160萬u））購自湖北遠成藥業(yè)有限公司；鼠抗人細胞角蛋白18抗體、羊抗鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；二甲亞砜（DMSO，廣州化學試劑廠）；苯溴馬隆（德國赫曼大藥廠）。

1.3 動物

3～5周SPF級昆明種小鼠，♂，體重（18±2）g，由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物實驗中心提供（動物使用合格證號：粵檢證字第2006B020號）。

2 方法

2.1 泄?jié)岢苑娇傸S酮的制備

泄?jié)岢苑筋w粒粉碎后，60%乙醇回流提取3次，總黃酮粗提液經(jīng)聚酰胺顆粒靜態(tài)吸附2 h達到平衡后，先以水洗脫，繼以乙醇洗脫，得到的總黃酮含量達71.84%。

2.2 小鼠RTECs的原代培養(yǎng)與鑒定

用優(yōu)化好的方法對目的細胞進行原代培養(yǎng)：處死小鼠后立即無菌取腎，去除包膜及脂肪組織，取皮質(zhì)部分，剪碎，消化，過篩，于37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。待細胞長滿后用0.25%胰蛋白酶處理細胞并進行傳代培養(yǎng)。制備細胞爬片，用細胞角蛋白18多克隆抗體（1∶250）為一抗[5]，羊抗鼠IgG為二抗，進行SP法染色鑒定。

2.3 泄?jié)岢苑娇傸S酮對RTECs增殖活性的影響

取3～5代RTECs，用2.5%的胰蛋白酶消化后再用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成1×105個/mL的細胞懸液，加入96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h使其貼壁后棄上清液，加入不同濃度的總黃酮（0、0.5、2.5、5.0、7.5、10.0 g·L－1）DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT（5 g·L－1）20 μL，培養(yǎng)結束后棄上清液，加入DMSO（100 μL）震蕩后于酶標儀490 nm波長處測定吸光度（A），結果以5個復孔的均值表示，參考MTT法公式計算增殖率。根據(jù)試驗結果選擇對細胞生長影響沒有統(tǒng)計學意義的濃度范圍，進行下一步尿酸吸收試驗。

2.4 泄?jié)岢苑娇傸S酮對RTECs尿酸吸收的影響

將細胞接種到96孔板，在室溫下進行尿酸吸收30 min。尿酸吸收試驗培養(yǎng)基成分為[6]：NaCl 137 mmol·L－1、KCl 5 mmol·L－1、K2HPO40.1 mmol·L－1、MgSO41.8 mmol·L－1、葡萄糖20 mmol·L－1、HEPEs 10 mmol·L－1（pH 7.4）。設定尿酸吸收取樣時間點分別為0、15、30、45、60、75、90 min。吸收結束后，使用尿酸檢測試劑盒檢測培養(yǎng)基中剩余尿酸濃度，顯色后，490 nm波長處檢測A值。差量法計算尿酸吸收值，確定試驗取樣時間點。

取3～5代RTECs，用2.5%的胰蛋白酶消化后再用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成1×105個/mL的細胞懸液，加入96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h使其貼壁后棄上清，根據(jù)MTT試驗確定的尿酸吸收試驗濃度，加入不同濃度的總黃酮（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L－1）DMEM培養(yǎng)基，以苯溴馬隆為陽性對照。藥物細胞孵育培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)基吸出，加入尿酸吸收培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，各測量孔吸取50 μL樣液，根據(jù)尿酸檢測試劑盒測定剩余尿酸濃度，差量法計算尿酸吸收值，并計算藥物作用于尿酸吸收的抑制率，結果以5個復孔抑制率的均值表示。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，試驗結果以±s表示，組間差異的比較采用單因素方差分析和t檢驗。

3 結果

3.1 小鼠RTECs的原代培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)約3 d后在腎小管節(jié)段邊緣有多邊形細胞呈島嶼狀長出，并逐漸增多向四周呈放射樣生長，至第10天，基本長滿培養(yǎng)瓶底。在倒置顯微鏡下觀察細胞具有鋪路石樣形態(tài)特征，細胞較大，排列緊密。細胞免疫組化染色反應顯示抗細胞角蛋白18染色陽性，胞質(zhì)內(nèi)見大量棕黃色顆粒，襯染的核呈藍色，純度在90%以上。小鼠RTECs原代培養(yǎng)10 d的情況見圖1；細胞免疫組化圖片見圖2。

圖1 小鼠RTECs原代培養(yǎng)10 d的情況Fig 1 The day 10 of mouse renal proximal tubule epithelial cell primary culture

圖2 細胞免疫組化圖片F(xiàn)ig 2 Cell immunohistochemistry picture

3.2 泄?jié)岢苑娇傸S酮對RTECs增殖活性的影響

高濃度泄?jié)岢苑娇傸S酮（10～5 g·L－1）能顯著抑制細胞活性，影響細胞增殖（P＜0.01）；低濃度泄?jié)岢苑娇傸S酮（2.5～0.5 g·L－1）對細胞的增殖活性幾乎不產(chǎn)生影響。因此，確定2.5～0.5 g·L－1作為尿酸吸收試驗的參考濃度范圍。泄?jié)岢苑娇傸S酮對RTECs增殖活性的影響見表1。

表1 泄?jié)岢苑娇傸S酮對RTECs增殖活性的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuo chubi decoction on the proliferation of RTECs（±s，n＝5）

表1 泄?jié)岢苑娇傸S酮對RTECs增殖活性的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuo chubi decoction on the proliferation of RTECs（±s，n＝5）

與0 g·L－1比較：＊P＜0.01vs.0 g·L－1：＊P＜0.01

濃度/g·L－1 0 0.5 2.5 5.0 7.5 10.0增殖率/%0.421±0.006 0.423±0.005 0.420±0.001 0.100±0.011＊0.010±0.001＊0.013±0.003＊

3.3 泄?jié)岢苑娇傸S酮對RTECs尿酸吸收的影響

通過前期試驗確定，尿酸吸收試驗的取樣時間點為30 min，即細胞進行尿酸吸收30 min后，終止吸收試驗，取樣測量培養(yǎng)基中剩余尿酸濃度。因為在該時間點，尿酸吸收速率達到最大且未達到飽和。與未加藥物刺激的RTECs細胞比較，在藥物刺激細胞48 h后，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L－1各濃度對尿酸吸收均有不同程度的抑制作用，其中較高濃度抑制作用較為強烈。泄?jié)岢苑娇傸S酮對RTECs尿酸吸收的影響見圖3。

4 討論

尿酸排泄減少是造成高尿酸血癥的一個主要原因，尿酸的排泄量取決于腎小管的分泌作用以及分泌后的重吸收作用。固定在腎臟近端小管上皮細胞管腔側和基底外側膜上的轉運蛋白負責尿酸的分泌和重吸收。

本課題組的前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，泄?jié)岢苑綄χ委煾吣蛩嵫Y有一定的療效，為了確定其發(fā)揮作用的活性成分，繼而對該藥方進行分離提取，總黃酮是所分離出的有效部位之一。本研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮在沒有對小鼠RTECs的增殖活性產(chǎn)生影響的前提下，能夠明顯抑制該細胞的尿酸吸收功能。提示總黃酮抑制RTECs的重吸收功能可能是泄?jié)岢苑街委煾吣蛩嵫Y的原因之一，而固定在該細胞上的URAT1是負責尿酸重吸收的主要蛋白，這為高尿酸血癥的治療和機制研究提供了新的理論依據(jù)。

圖3 泄?jié)岢苑娇傸S酮對RTECs尿酸吸收的影響Fig1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuochubi decoction on the uric uptake of RTECs

[1]Enomoto A，Kimura H，Chairoungdua A，et al.Molecular identification of a renal urate anion exchanger that regulates blood urate levels[J].Nature，2002，59（417）：447.

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[3]吳新榮，劉志剛，顏仁梁，等.聚酰胺顆粒分離純化土茯苓總黃酮研究[J].中藥材.2009，32（10）：1 606.

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[5]毛慧娟，王笑云，徐昌芬，等.人腎近端小管上皮細胞的原代培養(yǎng)、傳代及鑒定方法研究[J].南京醫(yī)科大學學報，2004，24（6）：561.

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