經前期綜合征肝氣郁證大鼠血清對海馬神經元5-HT1AR信號轉導通路的影響Δ

金航，張惠云（山東中醫藥大學中醫藥經典理論教育部重點實驗室，濟南250355）

近年來，經前期綜合征（Premenstrual Syndrome，PMS）已成為情志病證研究領域的代表性病種，本課題組的前期研究[1]已證實，41.9%的育齡婦女均有不同程度的PMS。PMS肝氣郁證是PMS的主要亞型，是肝疏泄不及的表現，是以經前出現抑郁寡歡等情緒異常，月經來潮后癥狀自行消失為主要臨床表現的病證。現已證實PMS癥狀的發生與中樞神經系統5-羥色胺（Serotonin，5-HT）能神經異常密切相關[2]。Ho HP等[3]等通過對5-HT受體及其與之相耦聯的G蛋白研究認為，PMS的產生可能與5-HT受體及其信號轉導異常有關。但目前對與編碼控制5-HT合成、釋放、重攝取、代謝以及受體活性有關的基因研究較少，如5-羥色胺轉運體（Serotonin transporter，SERT）基因、單胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）基因、5-羥色胺1A受體（Serotonin receptor-1A，5-HT1AR）基因等。

為了進一步探索PMS肝氣郁證發病的微觀作用機制，本課題組從細胞水平研究PMS肝氣郁證大鼠血清對海馬原代神經元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B蛋白和基因表達的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高速低溫離心機（上海天美科學儀器有限公司）；低溫冰箱（日本三洋公司）；CO2培養箱（上海力新有限公司）；倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；Tecan酶標儀（上海麥莎生物科技有限公司）；凝膠成像系統、FR-200A全自動紫外-可見分析儀（上海復日科技有限公司）；PCR擴增儀（大連寶生物工程有限公司）；ks 400圖像分析系統（德國Zeiss公司）。

1.2 試藥

經前舒顆粒（秦皇島市山海關制藥廠，批號：Z20053087）；神經基質、B27、谷氨酰胺（美國Gibico公司）；胎牛血清、多聚賴氨酸、MAO-B兔抗（批號：M1821）均購自美國Sigma公司；RNAisoTMPlus、Taq HS（不含 dNTP Mixture）、Rnase 抗化劑、dNTP Mixture、DL2 000 marker、Promega的RT反轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；預染蛋白marker（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BeyoECL Plus試劑盒（碧云天生物技術研究所）；5-HT1AR兔抗（批號：ab44635）、驢抗兔二抗（批號：ab16284）購自英國Abcam公司；驢抗羊二抗（批號：sc-2020）、MAO-A羊抗（批號：sc-18396）均購自美國Santa Cruz公司；SERT兔抗（美國Millipore公司，批號：AB1594P）。

表1 引物序列與RT-PCR反應參數Tab 1 The gene sequences of primers and RT-PCR reaction parameters

1.3 動物與神經元細胞

SPF級健康SD大鼠36只，♀，體重180～220 g；新生SD乳鼠（24 h）5只，均由山東中醫藥大學實驗動物中心提供（動物生產許可證號：SCXK（魯）20050015）。大鼠海馬區神經細胞由山東中醫藥大學中醫藥經典理論教育部重點實驗室培養。

2 方法

2.1 復制模型與含藥血清的制備

篩選處于非接受期的SD大鼠36只，隨機均分為正常、模型、經前舒組。根據文獻方法[4，5]，將模型組和經前舒組大鼠前足與對側后足用無菌紗布捆縛，妨礙其自由活動，以大鼠稍能活動、取食為度。復制模型同時，經前舒組大鼠給予經前舒顆粒（10 g·kg-1，相當于人臨床8倍劑量[6]）；正常、模型組大鼠給予相同體積的滅菌飲用水（10 mL·kg-1）。ig給藥，每天1次，連續5 d。復制模型、給藥完成后即進行宏觀行為學觀察和曠場實驗[7]。

給藥完畢斷頭取血，離心，收集血清，－70℃貯藏。使用前56℃滅活30 min，0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.2 大鼠血清中5-HT含量的測定

參照文獻[8]加以改進色譜條件。色譜柱：ZORBA×SB-C18（250 mm ×4.6 mm ，5 μm）；流動相：甲醇18%（V/V）-乙酸鈉（100 mmol·L-1）-檸檬酸（85 mmol·L-1）-正二丁胺（0.4 mmol·L-1）-辛烷基磺酸鈉（1.5 mmol·L-1）-乙二胺四乙酸（EDTA，0.2 mmol·L-1），調pH值至3.7；抽濾、脫氣；流速：0.9 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：18 ℃；工作電壓：0.4 mv；量程：1 μA。

2.3 RNA提取與RT-PCR檢測

將培養的新生大鼠海馬區神經元細胞分為3組，分別加入正常、模型、經前舒組大鼠血清，繼續培養24 h后收集細胞，運用RT-PCR半定量方法檢測大鼠海馬區神經元細胞中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B的mRNA相對表達量。按照RNAisoTMPlus試劑盒和Promega的RT反轉錄試劑盒說明進行RNA抽提和反轉錄。根據目的cDNA序列，用引物設計軟件（Primer 3）設計引物，由濟南博亞生物工程技術服務有限公司合成。引物序列與RT-PCR反應參數見表1（以β-actin作為內參，按下列公式計算各基因的相對表達豐度：被檢測基因表達豐度＝被檢測基因光密度值/β-actin光密度值；Tm為解鏈溫度）。

2.4 蛋白提取和Western blot法檢測

分組消化收獲35 mm培養皿對數生長期細胞，PBS洗滌1遍，加入100 μL RIPA（含1 mL PMSF：100∶1）冰浴裂解細胞，提取蛋白。Bradford法測定蛋白濃度，繪制濃度曲線。加入β-actin作為內參，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白，將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上（1 h）。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，分別與一抗（1∶200）于4℃孵育過夜，二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，BeyoECL Plus A液和B液顯色，曝光，對mRNA表達情況進行檢測。顯色過的NC膜用洗脫液室溫洗脫15 min，再用β-actin抗體孵育，ECL化學發光法顯色，用KS400圖像分析系統進行光密度掃描，以5-HT1AR、MAO-A、MAO-B、SERT基因的蛋白光密度值與對應內參光密度值的比值作為該樣品中5-HT1AR、MAO-A、MAO-B、SERT蛋白相對表達量參數，并進行統計分析。

2.5 統計學方法

利用SPSS 16.0統計軟件進行單因素方差分析，LSD法檢驗統計數據，所有數據均用±s表示。P＜0.05表示有顯著性差異。

3 結果

3.1 大鼠宏觀行為學觀察及曠場實驗評價

與正常組比較，模型組大鼠不活躍，精神萎靡，眼神呆滯，相互扎堆睡覺，對外界刺激不敏感；用電筆刺激，正常組大鼠激惹時常迅速躲開，模型組大鼠亦逃避電筆刺激，但反應遲緩，速度較慢；而經前舒組大鼠變化不明顯。

曠場實驗中水平得分和垂直得分分別反映動物的興奮性和動物對環境的適應性，而曠場總分是動物探索行為和興奮性的總體反映。結果表明，與正常組比較，模型組大鼠水平得分、垂直得分和曠場總分均顯著減少（P＜0.01），結合宏觀行為學觀察初步判定模型復制成功；與模型組比較，經前舒組大鼠水平得分、垂直得分和曠場總分均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），初步說明經前舒顆粒可緩解PMS肝氣郁證癥狀。大鼠曠場實驗得分見圖1。

3.2 大鼠血清中5-HT含量的測定

與正常組比較，模型組5-HT含量降低1/2左右（P＜0.01），經前舒組則無顯著性差異；與模型組比較，經前舒組5-HT含量顯著升高（P＜0.01）。大鼠血清中5-HT含量分析比較結果見表2。

3.3 大鼠血清對原代培養大鼠海馬神經元SERT、MAO-A、MAO-B、5-HT1AR mRNA表達量的影響

運用RT-PCR半定量方法檢測大鼠海馬神經元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B基因mRNA的相對表達量。與加入正常組大鼠血清的神經元細胞比較，模型組大鼠血清的干預能顯著影響海馬原代神經細胞中相關基因的表達：MAO-A mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），5-HT1AR、SERT mRNA表達量顯著降低（P＜0.05），可推測海馬神經元中MAO-A、SERT、5-HT1AR表達異常可能是導致經前抑郁的重要病因之一。加入經前舒干預大鼠血清能顯著改變神經元中相關基因表達水平異常升高或降低的狀態。本研究未發現MAO-B基因表達顯著增高或降低的現象，說明經前舒顆粒可能是通過調節MAO-A、5-HT1AR、SERT基因表達來發揮作用的。大鼠原代神經元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B的RT-PCR電泳圖見圖2；大鼠海馬原代神經細胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內參光密度比值見表3。

圖1 大鼠曠場實驗得分與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01 Fig 1 Score of the open field testvs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

表2 大鼠血清中5-HT含量分析比較結果（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of 5-HT content in rat serum（±s，n＝8）

表2 大鼠血清中5-HT含量分析比較結果（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of 5-HT content in rat serum（±s，n＝8）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

組別正常組模型組經前舒組5-HT/ng·mL-1 3 109.16±188.86 1 433.77±358.04＊2 904.15±292.60#

圖2 大鼠原代神經元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B的RT-PCR電泳圖A.5-羥色胺轉運體；B.5-羥色胺1A受體；C.單胺氧化酶-A；D.單胺氧化酶-B；M.DL2000 makerFig 2 RT-PCR electrophoretogram of 5-HT1AR，SERT and MAO-A，MAO-B in primary cultured neuronA.SERT；B.5-HT1AR；C.MAO-A；D.MAO-B；M.DL2000 marker

3.4 大鼠血清對原代培養大鼠海馬神經元SERT、MAO-A、MAO-B、5-HT1AR蛋白表達量的影響

運用Western blot方法檢測不同組大鼠血清對大鼠海馬神經元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B蛋白表達量的影響。與正常組比較，模型組大鼠血清的干預能顯著影響海馬原代神經細胞中相關蛋白的表達：MAO-A蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），而5-HT1AR、SERT 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；經前舒干預大鼠血清則能顯著改變神經元中相關蛋白表達水平異常升高或降低的狀態。本研究未發現MAO-B蛋白表達顯著增高或降低的現象，說明經前抑郁可能與大鼠海馬中MAO-A、5-HT1AR、SERT蛋白表達異常有關，而經前舒顆粒可能是通過調節這幾個基因來發揮作用的。Western blot方法分析大鼠原代神經元細胞中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B見圖3；大鼠海馬原代神經細胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內參光密度比見表4。

表3 大鼠海馬原代神經細胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內參光密度比值（±s，n＝3）Tab 3 The optical density ratio of internal reference to 5-HT1AR，SERT，MAO-A，MAO-B in primary hippocampal neurons（±s，n＝3）

表3 大鼠海馬原代神經細胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內參光密度比值（±s，n＝3）Tab 3 The optical density ratio of internal reference to 5-HT1AR，SERT，MAO-A，MAO-B in primary hippocampal neurons（±s，n＝3）

與正常組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

分組正常組模型組經前舒組SERT 0.523±0.048 0.237±0.033＊0.477±0.069#5-HT1AR 0.303±0.042 0.221±0.021＊0.305±0.048#MAO-A 0.597±0.153 1.132±0.132＊0.509±0.187#MAO-B 0.268±0.041 0.272±0.042 0.261±0.047

圖3 Western blot方法分析大鼠原代神經元細胞中5-HT1-AR、SERT、MAO-A、MAO-BA.5-羥色胺1A受體；B.5-羥色胺轉運體；C.單胺氧化酶-A；D.單胺氧化酶-BFig 3 Western blot analysis of 5-HT1AR，SERT，MAO-A、MAO-B in primary hippocampal neuronsA.5-HT1AR；B.SERT；C.MAO-A；D.MAO-B

表4 大鼠海馬原代神經細胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內參光密度比（±s，n＝3）Tab 4 The optical density ratio of internal reference to 5-HT1AR，SERT，MAO-A，MAO-B in primary hippocampal neurons（±s，n＝3）

表4 大鼠海馬原代神經細胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內參光密度比（±s，n＝3）Tab 4 The optical density ratio of internal reference to 5-HT1AR，SERT，MAO-A，MAO-B in primary hippocampal neurons（±s，n＝3）

與正常組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

分組正常組模型組經前舒組MAO-B 0.315±0.120 0.310±0.108 0.317±0.177 5-HT1AR 0.417±0.060 0.203±0.037＊0.405±0.018#SERT 0.232±0.049 0.113±0.010＊0.189±0.022#MAO-A 0.377±0.060 0.532±0.040＊0.414±0.035#

4 討論

中醫藥理論認為，肝臟疏泄功能失常是PMS的重要發病機制，疏泄太過產生肝氣逆證；疏泄不及產生肝氣郁證。PMS肝氣郁證的發病機制目前尚不明確，大多處于假說階段。

5-HT是中樞神經系統內一種重要的神經遞質，普遍認為中樞神經系統內5-HT能神經功能系統發生紊亂可能導致一系列不良情緒，如焦慮、抑郁、恐懼等的發生。5-HT1AR和情感障礙關系最為密切[9]。研究發現，抑郁癥患者海馬5-HT1AR的結合率下降、mRNA減少[10，11]。有研究發現，當神經沖動引起5-HT釋放到突觸間隙時，5-HT可被SERT再攝取到突觸前的5-HT神經元，重新循環釋放或被MAO降解[12]。Ravary A等[13]制備了SERT基因敲除小鼠，發現其5-HT的再攝取減少。另有研究表明，SERT敲除小鼠更容易有焦慮[14]和抑郁情緒[15]。MAO是單胺類神經遞質的一種重要代謝酶，分A和B兩型（MAO-A、MAO-B）[16]。MAO-A是5-HT合成及代謝的關鍵酶，與女性抑郁癥的發病有關[17]。MAO-B可通過生物激活神經毒素或是升高有害的H2O2的水平來加速大腦的老化[18]。

由本研究結果可以推測，血清中5-HT含量的改變是影響海馬神經元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B蛋白和基因表達的重要原因。根據PMS肝氣郁證與4種基因蛋白表達水平的相關性，可以進一步揭示PMS肝氣郁證的發病機制。本研究僅就目前研究結果初步推斷，PMS肝氣郁證可能與5-HT1AR、MAO-A、MAO-B、SERT信號轉導通路異常有關，這種異常可能與5-HT含量有關，而經前舒中的某些有效成分或其代謝成分可能通過影響5-HT的含量或直接作用調整5-HT1AR、MAO-A、MAO-B、SERT信號轉導通路，從而發揮治療PMS肝氣郁證的作用，但目前其具體作用機制尚不清楚，還需進行進一步研究。

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