高效液相色譜法測(cè)定蒲地藍(lán)消炎片中黃芩苷與黃芩素含量

邵禮梅，王云龍，李延雪

(黑龍江省雞西市藥品檢驗(yàn)所，黑龍江 雞西 158100)

蒲地藍(lán)消炎片由黃芩、蒲公英、板藍(lán)根、苦地丁4味中藥組方，具有清熱解毒、抗炎消腫的功效，用于癤腫、腮腺炎、淋巴腺炎、扁桃腺炎等癥。方中黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、止血，有效成分為黃芩苷、黃芩素[1]。其原標(biāo)準(zhǔn)[2]中沒(méi)有黃芩的含量測(cè)定方法和標(biāo)準(zhǔn)。為完善質(zhì)量控制方法，筆者以黃芩苷、黃芩素[1，3－5]為測(cè)定指標(biāo)，建立了同時(shí)測(cè)定蒲地藍(lán)消炎片中黃芩苷、黃芩素含量的高效液相色譜(HPLC)法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－2010A型高效液相色譜儀(島津)，包括LC－2010型紫外檢測(cè)器、在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、LCsolution色譜工作站;AG285型電子分析天平，KQ－400KDE型超聲波清洗器，TU－1901型雙光束紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)為110715－201016，含量以94.0%計(jì))、黃芩素對(duì)照品(批號(hào)為111595－200604)均來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;蒲地藍(lán)消炎片(批號(hào)分別為091110，20100701，101101，20101201);甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax SB －C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:A相為0.1%磷酸水溶液，C相為甲醇，梯度洗脫(0～40 min，60%→20%A，40%→80%C;40～60 min，20%→60%A，80%→40%C);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):274 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5μL。理論板數(shù)黃芩苷峰不低于5 000，黃芩素峰不低于7 000。

2.2 溶液制備

分別精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品24.16 mg(含量以94.0%計(jì))與黃芩素對(duì)照品8.49 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液A和B。分別精密吸取上述對(duì)照品貯備液A和B各5 mL，至同一20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成混合對(duì)照品溶液C(質(zhì)量濃度分別為黃芩苷56.78 μg/mL，黃芩素 21.22 μg/mL)，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得對(duì)照品溶液。取本品10片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約1片重，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液40 mL，密塞，超聲處理(功率 400 W，頻率36 kHz)30 min，取出，放冷，加70%乙醇溶液至刻度，搖勻，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方量并以相同工藝制備缺黃芩的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn):取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液，按擬訂的色譜條件測(cè)定，高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照品溶液色譜圖中，與黃芩苷、黃芩素對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明其他組分對(duì)其測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品混合溶液 C 0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定黃芩苷、黃芩素峰面積。分別以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，黃芩苷、黃芩素回歸方程分別為 Y苷=3.7×106 X+1 120.6，r苷=1.000 0(n=7);Y素=6.2 ×106 X+432.0，r素=1.0000(n=7)。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在 0.02839 ～0.62458μg、黃芩素進(jìn)樣量在0.010 61～0.233 42 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定黃芩苷、黃芩素峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積平均值為1 005 936.8，RSD=0.21%;黃芩素峰面積平均值為 634 524，RSD=0.07%(n=5)。表明在該條件下儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品(批號(hào)為101101)溶液，分別在0，2，4，8，12，16，24 h 時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積平均值為 477534.71，RSD=0.27%;黃芩素峰面積平均值為 288575.71，RSD=0.28%(n=7)。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn):分別精密稱(chēng)取樣品(批號(hào)為101101)5份，按供試品溶液的制備方法制備溶液并測(cè)定含量。結(jié)果黃芩苷平均含量為 6.73 mg/片，RSD=0.37%;黃芩素平均含量為 2.41 mg/片，RSD=0.53%。結(jié)果表明，方法的重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):稱(chēng)取已知含量的同一批樣品(批號(hào)為101101，平均片重 0.300 7 g，黃芩苷含量為 6.73 mg/片;黃芩素含量為 2.41 mg/片)約 0.15 g，精密稱(chēng)定，共 6 份，以?xún)煞轂橐唤M，每組分別精密加入黃芩苷對(duì)照品 2.695，3.350，4.035 mg 與黃芩素對(duì)照品 0.965，1.200，1.445 mg，按 2.2 項(xiàng)下方法制成供試品溶液。在擬訂的色譜條件下，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷與黃芩素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取4批不同廠家的市售樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中黃芩苷、黃芩素的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=4)

3 討論

曾考察了回流法和超聲法，由于回流法過(guò)程比較煩瑣，易造成損失，故選擇操作簡(jiǎn)便的超聲法。對(duì)于超聲提取，本試驗(yàn)對(duì)溶劑種類(lèi)(乙醇、70%乙醇溶液、水)進(jìn)行了考察，超聲時(shí)間考察了20，30，40 min，結(jié)果70%乙醇溶液提取30 min效果較好。

對(duì)黃芩苷、黃芩素對(duì)照品溶液在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果黃芩苷在279 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，黃芩素在277 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。藥典[5]中，黃芩苷在274nm波長(zhǎng)處也可進(jìn)行含量測(cè)定，因此選擇274 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在274 nm波長(zhǎng)處所得的色譜圖上各成分分離效果較好。

選擇合適的流動(dòng)相梯度對(duì)樣品進(jìn)行有效分離起著關(guān)鍵的作用。本制劑為中成藥，成分較復(fù)雜，采用梯度洗脫的方法，可以使黃芩苷、黃芩素和干擾雜質(zhì)進(jìn)行有效分離，從而達(dá)到更理想的分離效果。

[1]車(chē)慶明，薛彬彬，陳 穎.高效液相色譜法測(cè)定雙黃連制劑中黃芩苷和黃芩素的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(2):211－213.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第三冊(cè))[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:187.

[3]潘 馨.高效液相色譜法測(cè)定銀黃膠囊中綠原酸及黃芩苷的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2003，20(6):493 －495.

[4]馮有龍，余伯陽(yáng)，董小平.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定三黃片中的蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)及生物堿類(lèi)化合物[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41(3):285－288.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:612－613.