復方甘草酸苷制劑對脂多糖誘導小鼠RAW264.7細胞分泌炎癥因子的調節作用

王 松， 王 微， 羅 猛， 趙修華， 祖元剛， 趙艷麗

(東北林業大學教育部林業生物制劑工程研究中心森林植物生態學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

炎癥是機體受到各種致炎因素的刺激和損傷后為滅活及移除這些致炎因素并為組織修復創造環境而產生的防御性反應，是一種十分常見而又重要的基本病理過程，是許多疾病的癥狀或并發癥，可引起局部或全身性反應。其主要由細菌和病毒引起，也可因物理、化學、外傷等刺激而產生［1］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的組成成分，為重要的炎癥反應觸發劑，并誘導多種細胞因子參與炎癥反應。在炎癥反應中，巨噬細胞起著重要作用，是體內啟動炎癥介質產生的中心細胞，活化的巨噬細胞即是參與炎癥反應的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及白介素 IL-1β、-6、-10 等細胞因子的重要來源［2-4］，為調控炎癥反應的主要細胞，由炎癥反應所致免疫防御和免疫功能紊亂過程中，巨噬細胞是一個關鍵的參與者。所以，研究LPS刺激巨噬細胞產生促炎性和抗炎性細胞因子的效應，有助于人們對炎癥反應機制的認識，并尋找到其有效防治手段。

在日本米諾發源制藥株式會社研制的復方甘草酸苷(compound glycyrrhizin，GL)片劑(GLT)和注射劑(GLI)2種劑型中，GLT主要成分為甘草酸苷(即甘草酸單銨鹽)、甘氨酸和蛋氨酸，而GLI則以甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸和甘氨酸為主成分，輔料有亞硫酸鈉、適量氨水和氯化鈉。這2種復方制劑均具有抗炎和類鹽皮質激素的作用，同時還具有抑制病毒增殖、免疫調節、降低轉氨酶、改善肝組織損傷、抗變態反應、抗氧化、保護細胞膜結構等多種生物學作用，臨床上主要用于治療慢性肝炎、濕疹、皮膚炎、過敏性紫癜、水痘、銀屑病及斑禿等疾病，并有良好療效［5-6］。研究表明，炎癥反應其本質就是機體內促炎-抗炎自穩失衡所致。在參與炎癥反應的眾多因子中，最重要的是炎癥因子TNF-α及IL-1β、-6和-10以及炎癥介質一氧化氮(NO)，它們與內毒素休克的發病與致死具有密切關聯［7-9］。本文旨在通過研究GLT和GLI對LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌促炎和抗炎細胞因子TNF-α及IL-1β、-6和-10以及炎癥介質NO的調節作用，探討GL的抗炎作用機制，為其用于臨床治療提供實驗依據。其間，選用地塞米松作為陽性對照藥，它為一種糖皮質激素類抗炎藥，可部分抑制NO生成，其作用確切，臨床應用廣泛。

1 材料

1.1 藥物與試劑

高糖DMEM培養基，胎牛血清，青霉素，鏈霉素，均為Hyclone公司產品;胰蛋白酶(Gibco公司);EDTA，MTT(噻唑藍)，LPS，均為 Sigma公司產品;二甲基亞砜(DMSO，Amerseco公司);NO檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所);小鼠的TNF-α及IL-6、-1β和-10的ELISA試劑盒(ELISA Kits，R＆D公司);GLT(每片含甘草酸苷35 mg，批號:09059)，GLI(每支20 mL，含甘草酸苷 53 mg，批號:E0211)，均為衛材(中國)藥業有限公司產品;地塞米松(Sigma公司)。

1.2 細胞株

小鼠巨噬細胞RAW264.7，購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 儀器

DL-CJ-2N型超凈工作臺(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司);DK-98-1型電子恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司);LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠);StatFax-2100型酶標儀(美國Awareness公司);CO2培養箱(SIM公司);TS-100型倒置顯微鏡(美國AWARENESS公司)。

2 方法

2.1 藥物溶液配制

GLT藥液配制:取GLT，用研缽研成粉末，置于139 mL含有2%血清的DMEM培養液中，超聲溶解，使甘草酸苷濃度為 300 μmol·L-1，放置過夜，使用前以0.45 μm濾膜過濾除菌，并用含有2%血清的DMEM培養液倍半稀釋，使甘草酸苷濃度分別達150 和 75 μmol·L-1，即得 300、150 和 75 μmol·L-1的3個濃度GLT藥液。

GLI藥液配制:取 GLI，用含有 2%血清的DMEM培養液以10.5倍稀釋，使甘草酸苷濃度為300 μmol·L-1，放置過夜，使用前同上處理和稀釋，即得300、150 和75 μmol·L-1的3 個濃度 GLI藥液。

地塞米松藥液配制:取地塞米松粉末100 μg，溶解于2 mL含有2%血清的DMEM培養液中，制得濃度為127 μmol·L-1的藥液，使用前再用培養液稀釋至 1.27 μmol·L-1即可。

LPS溶液配制:取LPS粉末1 mg，溶解在1 mL生理鹽水中，制成質量濃度為1000 mg·L-1的LPS溶液，使用前用含有2%血清的DMEM培養液稀釋至10 或 1 mg·L-1即可。

2.2 細胞培養

將RAW 264.7細胞置于高糖DMEM培養基中，并添加10%胎牛血清以及青霉素和鏈霉素各100 mg·L-1，隨后在 37 ℃、潮濕、含5%CO2的培養箱中培養。

2.3 MTT實驗

取對數生長期的RAW 264.7細胞，制得細胞濃度為每毫升4×105個的單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，培養過夜;吸棄各孔培養液，分組處理，即GLT和GLI藥液各濃度組分別加入300、150 和75 μmol·L-13 個濃度的相應藥液，LPS模型組加1 mg·L-1LPS溶液，空白對照組加含2%胎牛血清的DMEM培養液，每組平行5孔，各孔加液體積為200 μL，繼續培養;24 h后，各孔加入20 μL MTT 的生理鹽水溶液(5 g·L-1)，再培養4 h;吸棄培養液，每孔加入150 μL DMSO溶解，水平振蕩器搖動10 min，用酶標儀在檢測波長492 nm和參比波長630 nm下測定吸光值，計算各組細胞活力，并將空白對照組細胞活力計作100%。實驗重復3次。

2.4 Griess實驗

取對數生長期的RAW 264.7細胞，制得細胞濃度為每毫升4×105個的單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，培養過夜;棄去各孔培養液，分組處理，即GLT和GLI藥液各濃度組分別加入300、150和75μmol·L-13個濃度的相應藥液，LPS模型組和空白對照組加含2%胎牛血清的DMEM 培養液，陽性對照組加 1.27 μmol·L-1地塞米松藥液，每組平行5孔，各孔加液體積為180 μL;處理1 h后，空白對照組加入含2%胎牛血清的DMEM培養液，其他各組均加10 mg·L-1LPS溶液(LPS最終質量濃度為1 mg·L-1)，每孔加液體積為20 μL;培養24 h 后，吸取各孔培養液50 μL，加入等體積的Griess試劑1和試劑2，室溫反應10 min，用酶標儀在540 nm處測定吸光值，依據所測亞硝酸鹽濃度，推算各組細胞培養液中NO含量，繼而計算各藥液組對LPS處理的細胞產生NO的抑制率。實驗重復3次，并進行組間比較。抑制率=(LPS模型組吸光值-各藥液組吸光值)/(LPS模型組吸光值-空白組吸光值)×100%。

2.5 雙抗體夾心ABC-ELISA實驗

該項實驗旨在考察不同濃度GLT和GLI藥液對LPS刺激的RAW264.7細胞分泌促炎和抗炎細胞因子TNF-α及IL-1β、-6和-10的影響，其前部分細胞分組、處理等設計同“2.4”節;各組細胞培養24 h后，按照各細胞因子相應的ELISA試劑盒說明書操作，吸取各孔培養液，用酶標儀在450 nm波長處測定吸光值，依據標準曲線，計算各組培養液中TNF-α及IL-1β、-6和-10的含量。實驗重復3次，并進行組間比較。

2.6 數據分析

3 結果

3.1 復方甘草酸苷片劑和注射劑對細胞活力的影響

MTT實驗結果顯示，GLT和GLI藥液各濃度組細胞活力與空白對照組和LPS模型組無顯著差異(P＞0.05)(見圖1)。提示，GLT和GLI藥液在0～300 μmol·L-1濃度范圍內對 RAW264.7 細胞的活力無影響。

圖1 MTT實驗中各組細胞活力比較(n=15)Figure 1 Comparison of cell viability among all groups in MTT test

3.2 復方甘草酸苷片劑和注射劑對脂多糖誘導細胞產生NO的抑制作用

Griess實驗結果顯示，LPS模型組細胞培養液中NO含量較空白對照組顯著提高，說明LPS可誘導RAW264.7細胞產生大量的NO，體外炎癥模型建立成功;GLI藥液在75、150和300μmol·L-1濃度下對LPS誘導細胞產生NO的抑制率分別為13.8%、40.4%和53.8%，而GLT藥液在這3個濃度下的抑制率分別為9.8%、27.1%和37.8%，地塞米松在1.27 μmol·L-1濃度下的抑制率為27.1%(見圖2)。表明，GLT和GLI能不同程度地顯著抑制LPS誘導細胞產生NO，并呈濃度依賴性，且其作用與陽性對照藥地塞米松類似，其中GLI的抑制作用稍強于GLT。

圖2 Griess實驗中各組細胞培養液的亞硝酸鹽濃度比較(n=15)Figure 2 Comparison of nitrite concentration in cell culture among all groups in Griess test

3.3 復方甘草酸苷片劑和注射劑對脂多糖誘導細胞分泌TNF-α及IL-1β、-6和-10的影響

ELISA實驗結果顯示，與空白對照組比較，LPS模型組細胞培養液中的TNF-α及IL-1β、-6和-10含量顯著提高;與LPS模型組比較，在75、150和300 μmol·L-1的GLI藥液組細胞培養液中TNF-α含量分別降低29.8%、41.5%和52.1%，IL-1β含量分別降低39.5%、55.6%和69.6%，IL-6含量分別降低18.3%、29.5%和39.1%，IL-10含量則分別提高8.2%、23.8% 和 30.8%，而在 75、150 和 300 μmol·L-1的GLT藥液組細胞培養液中，TNF-α含量分別降低16.6%、37.0%和48.4%，IL-1β含量分別降低28.1%、47.9%和57.9%，IL-6含量分別降低13.5%、19.9%和28.2%，IL-10含量則分別提高3.9%、14.8%和23.4%，此外，陽性對照組細胞培養液中TNF-α及IL-1β和-6含量分別降低47.5%、53.8%和44.7%，IL-10 含量則提高 23.0%(見圖 3、4、5、6)。可見，GLT和GLI能不同程度地顯著抑制LPS誘導細胞分泌TNF-α及IL-1β和-6以及進一步促進細胞分泌IL-10，并呈濃度依賴性，且其作用與陽性對照藥地塞米松類似，其中GLI的作用強于GLT。

圖3 ELISA實驗中各組細胞培養液的TNF-α含量比較(n=15)Figure 3 Comparison of TNF-α content in cell culture among all groups in ELISA test

圖4 ELISA實驗中各組細胞培養液的IL-1β含量比較(n=15)Figure 4 Comparison of IL-1β content in cell culture among all groups in ELISA test

圖5 ELISA實驗中各組細胞培養液的IL-6含量比較(n=15)Figure 5 Comparison of IL-6 content in cell culture among all groups in ELISA test

圖6 ELISA實驗中各組細胞培養液的IL-10含量比較(n=15)Figure 6 Comparison of IL-10 content in cell culture among all groups in ELISA test

4 討論

GL目前已在臨床上廣泛應用，療效顯著，而抗炎是其主要藥理作用。NF-κB作為一種核轉錄因子，具有調節炎癥、疼痛、病毒復制以及一些免疫疾病中關鍵因子基因表達的作用，如在炎癥發生過程中，其能調節IL-1β、TNF-α、誘導型NO合酶(iNOS)等基因的表達，故阻斷NF-κB通路是抗炎治療的有效途徑［10-11］，包括地塞米松等抗炎藥都是通過抑制NF-κB 的活性來降低 IL-1β、TNF-α、NO 等的生成，從而達到治療目的。本研究成功建立了LPS誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7體外炎癥模型，并考察了GL在不同濃度下對其中NO、TNF-α及IL-1β、-6和-10等炎癥因子分泌的調節作用，在細胞水平上證實了GL具有與地塞米松等甾體類藥物相似的良好抗炎活性。

在本研究中，考慮到GLI原液的濃度約為3154 μmol·L-1，而作用于細胞的藥物濃度過高(即稀釋倍數過低)可能會因毒性作用而影響細胞正常生長，導致實驗結果不準確，所以，基于預實驗和GLI市面上出售的藥品規格，把GLT和GLI藥液的實驗濃度選定稀釋在0～300 μmol·L-1范圍內。結果表明，與LPS模型組相比，GL可濃度依賴性地顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞分泌NO、TNF-α、IL-1β和-6等促炎因子，并能促進抗炎因子IL-10的產生，顯示了其體外抗炎效應。其中，在高濃度下，GLI對NO、TNF-α和IL-1β的細胞分泌抑制率都超過50%，而GLT只有對IL-1β的細胞分泌抑制率超過50%，且整體實驗結果也顯示，GLI的各項體外抗炎活性數據均優于GLT。究其個中緣由，筆者以為，可能與注射液對生產工藝以及藥物純度等各方面的要求嚴于或優于片劑有關。

依據本研究結果，可以初步推測GL的抗炎作用機制是阻斷NF-κB活性，因此筆者所在研究團隊下一步將深入探究GL對NF-κB等通路的作用，進一步闡釋GL的抗炎機制。

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