用HPLC-ESI-IT-MSn法研究慶大霉素C1a的雜質(zhì)譜

楊 昊，袁耀佐，趙 恂，譚 力，張 玫，錢 文

江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，南京 210009

臨床上使用的慶大霉素（Gentamicin，GM）是由小單孢菌屬發(fā)酵產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)相近的、多組分的氨基糖苷類抗生素，以 C 族復(fù)合物（C1、C2、C1a、C2a）為主，圖1為慶大霉素及其部分雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式[1]。由于它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上的差異，故生物活性和毒性不相同。C1毒副作用小，不易耐藥，但療效不如C2和C1a，而C2和C1a雖療效高，但毒性大且易耐藥[2]。趙敏等[3]的研究，以慶大霉素 C1a（GMC1a）為母核，經(jīng)半合成改造，得到另一個(gè)新抗生素——依替米星（Etimicin，ETM）。該藥具有抗菌活性強(qiáng)、療效好、毒性低、抗耐藥菌等優(yōu)點(diǎn)，已被《中國(guó)藥典》收載。工業(yè)化生產(chǎn)ETM需要大量高純度低價(jià)格的GMC1a，為此，趙敏等[4]利用紫外光和氯化鋰復(fù)合因子處理小諾霉素產(chǎn)生菌棘孢小單孢菌JIM-401，獲得一發(fā)酵產(chǎn)生慶大霉素C1a單一組分的突變株JIM-202，又通過(guò)推理育種技術(shù)[5]，獲得慶大霉素C1a單組分高產(chǎn)菌，并在生產(chǎn)中得到應(yīng)用。

圖1 慶大霉素及部分雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

雜質(zhì)譜（impurity profile）的分析，即分析樣品中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)和含量的分布情況，在原料藥中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[6]，但在中間體中的應(yīng)用鮮見，作者在研究依替米星的雜質(zhì)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源慶大霉素C1a合成的依替米星，雜質(zhì)譜不同，有時(shí)還有較大的差異，甚至可能產(chǎn)生含量較大的新雜質(zhì)，其安全性如何在臨床上沒(méi)有得到驗(yàn)證，直接給產(chǎn)品帶來(lái)安全隱患。從全面質(zhì)量管理的理念而言，有必要對(duì)慶大霉素C1a的雜質(zhì)譜進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

隨LC-MS聯(lián)用技術(shù)的成熟，LC-MSn在氨基糖苷類抗生素雜質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中應(yīng)用報(bào)道很多[7-9]，因氨基糖苷類抗生素極性很大，在反相色譜柱上不保留，文獻(xiàn)中大多采用在流動(dòng)相添加多氟有機(jī)酸改善色譜保留，而氟有機(jī)酸影響質(zhì)譜的離子化效率，尤其是當(dāng)采用電噴霧離子源時(shí)，正離子的形成幾乎是不可能的，早期的文獻(xiàn)中，消除離子抑制效率主要采用TFAfix技術(shù)[10]，即根據(jù)實(shí)際情況在柱后添加揮發(fā)性小于多氟有機(jī)酸的其他有機(jī)酸，由于在柱后添加需要增加泵系統(tǒng)，比較費(fèi)事，后來(lái)部分實(shí)驗(yàn)采用在流動(dòng)相直接添加低揮發(fā)性有機(jī)酸或通過(guò)用氨水調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH至2.0的辦法。Grahek[1]在研究慶大霉素雜質(zhì)譜時(shí)還發(fā)現(xiàn)，采用APCI源代替ESI源，可以使靈敏度得到明顯提高。上述方法在一定程度上解決了氨基糖苷類抗生素的色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)之間的矛盾，但在質(zhì)譜儀中會(huì)有大量的多氟有機(jī)酸殘留，給質(zhì)譜儀的維護(hù)帶來(lái)困難，長(zhǎng)期使用，會(huì)大大降低儀器檢測(cè)靈敏度，為此，作者在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[11]，采用寬pH范圍的色譜柱，在高pH值的流動(dòng)相中，分離氨基糖苷類抗生素，用質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，并采用多級(jí)質(zhì)譜對(duì)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，成功地分析了依替米星[12]、小諾霉素[13]、奈替米星、西索米星的雜質(zhì)譜，該方法在國(guó)內(nèi)外均為首次報(bào)道。

本文是在文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上，建立了用于慶大霉素C1a雜質(zhì)譜研究的HPLC-ESI-IT-MSn方法，從慶大霉素C1a樣品中共檢出13個(gè)雜質(zhì)，采用與雜質(zhì)對(duì)照品比對(duì)色譜保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜的方法，對(duì)2個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證；利用已經(jīng)總結(jié)出來(lái)的氨基糖苷類抗生素的特征裂解碎片離子和質(zhì)譜裂解規(guī)律[12-13]，根據(jù)一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，對(duì)另外12個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行推定。

1 材 料

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100 LC/MSD Trap液質(zhì)聯(lián)用儀 （美國(guó)Agilent公司）。

慶大霉素C1a（常州方圓制藥有限公司）；慶大霉素、依替米星、小諾霉素等對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇為色譜純；其余均為分析純。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱:Gemini NX C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，美國(guó) Phenomnex 公司)；流動(dòng)相:[水-氨水-冰醋酸（96∶3.6∶0.4）]-甲醇（85∶15）；流速:1 mL·min-1；柱溫:35℃；進(jìn)樣量:20μL；柱后分流比:7∶3。

離子源:ESI源；離子源溫度:350℃；霧化室壓力:275.8 kPa；干燥氣流速:10 L·min-1；離子掃描范圍:100～900 m/z；正離子方式檢測(cè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 慶大霉素C1a的LC-MS分析

取慶大霉素C1a適量，用水溶解并稀釋制成含慶大霉素C1a約5 mg·mL-1的溶液，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描（Full scan）和二級(jí)質(zhì)譜離子全掃描（Full scan-MS2）。 圖 2為 LC-MS的總離子流圖（TIC）；表 1為慶大霉素C1a及其主要雜質(zhì)的色譜保留時(shí)間及對(duì)應(yīng)的一、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

圖2 慶大霉素C1a的LC-MS（TIC）圖

表1 慶大霉素C1a及主要雜質(zhì)LC-MS測(cè)定數(shù)據(jù)

2.2 雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定

雜質(zhì)1的[M+H]+m/z 469，與慶大霉素A的分子量吻合 （MW 468），其二級(jí)質(zhì)譜為 [M+H]+m/z 451、420、366、348、324、308、205、187、163、146， 用慶大霉素A的結(jié)構(gòu)解析，各碎片離子均能得到合理解釋，裂解途徑如圖3所示。鄭衛(wèi)等[14]報(bào)道小單孢菌FM-203能產(chǎn)生慶大霉素A組分，旁證結(jié)構(gòu)推定的合理性，表明雜質(zhì)1為慶大霉素A。

圖3 雜質(zhì)1（慶大霉素A）二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)2的[M+H]+m/z 468，其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z 450、419、365、347、323、308、205、187、163、146，其分子量比慶大霉素A少1 Da，與慶大霉素A二級(jí)質(zhì)譜對(duì)應(yīng)離子比較，碎片離子m/z 348、308、205、187、163、146 完全相同， 碎片離子 m/z 450、419、365、347、323少1 Da，可見，雜質(zhì)2具有慶大霉素A的B+C環(huán)結(jié)構(gòu)，但A環(huán)結(jié)構(gòu)中某個(gè)羥基應(yīng)被氨基替換，可能的結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 雜質(zhì)2二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)3的[M+H]+m/z 322，與慶大霉素C1a脫去A環(huán)得到的降解產(chǎn)物（B+C環(huán)）的加氫離子的質(zhì)荷比吻合，提示該組分為慶大霉素C1a失去A環(huán)的降解物，即加洛糖胺（garamine），其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z 205、187、163、160、142、129、112，各碎片離子均能得到合理解釋，裂解途徑如圖5所示，證明雜質(zhì)3為加洛糖胺。

圖5 雜質(zhì)3（加洛糖胺）二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)4的[M+H]+m/z 483，與慶大霉素B的分子量吻合，其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z 434、366、348、324、323、322、307、255、228、189、163、144， 各 碎 片離子均能得到合理解釋，裂解途徑如圖6所示，黎俊等[15]發(fā)現(xiàn)慶大霉素C1a的產(chǎn)生菌（棘孢小單孢菌）可以產(chǎn)生慶大霉素B，旁證該結(jié)構(gòu)推定的合理性，即雜質(zhì)4為慶大霉素B。

圖6 雜質(zhì)4（慶大霉素B）二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)5的[M+H]+m/z 305，與 gentamineC2、C2a、C2b（小諾霉素脫C環(huán)的降解物）相同（如圖1所示），其二級(jí)質(zhì)譜為 [M+H]+m/z 288、163、143、126、112，用上述三候選結(jié)構(gòu)對(duì)二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行解析，均能使所有碎片得到合理解釋，考慮到樣品中小諾霉素（為主要雜質(zhì)），雜質(zhì)5的結(jié)構(gòu)為gentamine C2b可能性更大。見圖7。

圖7 雜質(zhì)5（gentamine C2b）二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)6的[M+H]+m/z 431，與西索米星的分子量差17 Da，提示可能比其少1分子氨，二級(jí)質(zhì)譜為m/z 332、314、296、272、269、254、227、199、173、163、160、154，其中m/z 163、160分別為西索米星的 B環(huán)和C環(huán)的特征離子[8]，提示雜質(zhì)6中有這兩特征基團(tuán)，由此可知缺少的1分子氨應(yīng)在A環(huán)結(jié)構(gòu)中，根據(jù)上述分析，雜質(zhì)6可能的結(jié)構(gòu)如圖8所示，該結(jié)構(gòu)可以合理解釋二級(jí)質(zhì)譜中的主要碎片離子。

圖8 雜質(zhì)6二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)7的[M+H]+m/z 446，其二級(jí)質(zhì)譜為318、290、160、142；目前無(wú)分子量為445 Da的氨基糖苷類抗生素的結(jié)構(gòu)報(bào)道，僅根據(jù)這些質(zhì)譜信息無(wú)法推測(cè)其結(jié)構(gòu)。

雜質(zhì)8的[M+H]+m/z 450，其二級(jí)質(zhì)譜碎片離子 m/z 433、308、288、205、187、163、143，文獻(xiàn)[1]報(bào)道慶大霉素原料中 [M+H]+m/z 450組分除慶大霉素C1a外，還發(fā)現(xiàn)有慶大霉素Ⅶ-2和慶大霉素Y-02077H（如圖1所示），用這兩結(jié)構(gòu)均能合理解釋，故從二級(jí)質(zhì)譜上無(wú)法區(qū)分A環(huán)的6位上的甲基的連接方式，進(jìn)一步用多級(jí)質(zhì)譜對(duì)特征離子m/z 143進(jìn)行分析，得到三級(jí)質(zhì)譜為 m/z 143、126、109，表明A環(huán)中有兩個(gè)自由的氨基，這與慶大霉素Ⅶ-2結(jié)構(gòu)吻合，表明雜質(zhì)8為慶大霉素Ⅶ-2，其二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程如圖9所示。

雜質(zhì)9的[M+H]+m/z 492，比小諾霉素的[M+H]+大 28 Da，其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z 475、350、305、188、163、143,其中m/z是小諾霉素的A+B環(huán)特征離子，m/z 163是慶大霉素C1a的B環(huán)特征離子[12-13]，提示雜質(zhì)9中有小諾霉素的A+B環(huán)結(jié)構(gòu)，增加的結(jié)構(gòu)部分應(yīng)連接在C環(huán)上，文獻(xiàn)[1]報(bào)道，慶大霉素原料中分離出3個(gè) [M+H]+m/z 492組分的結(jié)構(gòu)，其中XK-62-7的結(jié)構(gòu)能合理解釋其二級(jí)質(zhì)譜，雜質(zhì)9可能的結(jié)構(gòu)如圖10所示。

圖9 雜質(zhì)8（Ⅶ-2）二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

圖10 雜質(zhì)9（XK-62-7）二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)10和雜質(zhì)13的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜及色譜保留分別與西索米星和小諾霉素一致（質(zhì)譜及色譜保留時(shí)間見表1），即為雜質(zhì)10為西索米星，雜質(zhì)13為小諾霉素。

雜質(zhì)11的[M+H]+m/z 451，比慶大霉素C1a的分子量多1 Da，其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z 434、334、322、292、275、205、163、160、142， 其 中 m/z322、205、163、160、142 是慶大霉素 C1a中 B+C 環(huán)的特征離子[12-13]，提示雜質(zhì)11結(jié)構(gòu)中有慶大霉素C1a的B+C環(huán)結(jié)構(gòu)，增加的1 Da應(yīng)發(fā)生在A環(huán)上，即雜質(zhì)11的結(jié)構(gòu)為慶大霉素C1a的A環(huán)中某個(gè)氨基為羥基替代而得，如圖11所示。

圖11 雜質(zhì)11二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

雜質(zhì)12的[M+H]+m/z 462，比小諾霉素的分子量（[M+H]+m/z 464）少2Da，提示結(jié)構(gòu)中有雙鍵，其二級(jí)質(zhì)譜為 444、413、322、303、285、254、205、163、160、142，其中碎片離子 m/z 322、205、163、160 為小諾霉素的B+C環(huán)特征離子[12-13]在A環(huán)上，倪雍富等[16]曾從橄欖星孢小單孢菌無(wú)錫亞種M-41的發(fā)酵液中分離到威達(dá)米星（verdamicin），該結(jié)構(gòu)可以合理解釋上述二級(jí)質(zhì)譜中所有碎片離子，可見雜質(zhì)12可能為威達(dá)米星，結(jié)構(gòu)如圖12所示。

圖12 雜質(zhì)12（verdamicin）二級(jí)質(zhì)譜可能的裂解途徑

3 討 論

本研究首次建立用于慶大霉素C1a中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推定的HPLC-ESI-IT-MSn方法，并從慶大霉素C1a中檢出13個(gè)雜質(zhì)，對(duì)其中的12個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推定 （見表1），該方法可以用于本品雜質(zhì)譜的研究。由于樣品有限，未對(duì)不同批次、不同來(lái)源的慶大霉素C1a中雜質(zhì)的種類和含量之間的變化情況進(jìn)行分析。

推定結(jié)構(gòu)基本思路因有無(wú)雜質(zhì)對(duì)照品而異。對(duì)有對(duì)照品的雜質(zhì)，則通過(guò)比對(duì)兩者的色譜保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜，來(lái)確證結(jié)構(gòu)。對(duì)無(wú)對(duì)照品的雜質(zhì)，則利用已經(jīng)總結(jié)出來(lái)的氨基糖苷類抗生素的特征裂解碎片離子和質(zhì)譜裂解規(guī)律，通過(guò)一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜或多級(jí)質(zhì)譜信息，對(duì)未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo)，有時(shí)還需要查閱相關(guān)文獻(xiàn)或生產(chǎn)工藝，對(duì)結(jié)果進(jìn)行佐證。

通過(guò)二級(jí)或多級(jí)質(zhì)譜信息推導(dǎo)結(jié)構(gòu)時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)中部分基團(tuán)的位置或空間構(gòu)型無(wú)法確定，這是用LC-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的一個(gè)缺陷。由于這些雜質(zhì)在樣品中含量極微，用富集的制備方法獲得雜質(zhì)精制品的工作量大，甚至還需要特殊的設(shè)備，成為未知雜質(zhì)研究的瓶頸所在，期待更先進(jìn)的分析手段如LC-NMR加速發(fā)展來(lái)推動(dòng)這方面工作的深入研究。

與其他氨基糖苷類抗生素一樣，慶大霉素C1a中含有很多氨基和羥基，溶液狀態(tài)下易離子化，故實(shí)驗(yàn)中選用電噴霧離子化方法，分別用正、負(fù)離子模式掃描慶大霉素C1a溶液，結(jié)果顯示，正離子模式下檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于負(fù)離子檢測(cè)模式，合理的解釋為:流動(dòng)相中氨水的揮發(fā)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于冰醋酸，電噴霧形成的液滴在去溶劑時(shí)氨水部分先揮發(fā)去除，使殘存液滴由原先的堿性轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝裕峁潆x子，慶大霉素C1a及其雜質(zhì)經(jīng)庫(kù)侖爆炸后呈現(xiàn)為加氫離子，故實(shí)驗(yàn)中選擇正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

[1]Grahek R,Zupancic-Kralj L.Identification of gentamicin impurities by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal,2009,50(5):1037-43.

[2]楊蘊(yùn)劉，鄭霏琴，王宗陽(yáng)，等.慶大霉素3種組分對(duì)綠膿假單胞菌抗菌活力的比較 [J].抗生素，1982，7（1）:12-6.

[3]趙敏，范瑾.半合成新抗生素——依替米星[J].醫(yī)藥研究通訊，2002，31（7）:24-5.

[4]趙 敏，范 瑾，胡小玲，等.慶大霉素C1a單組分產(chǎn)生菌-棘孢小單孢菌JIM-202的篩選和研究[J].中國(guó)抗生素雜志，1997，22（1）:12.

[5]范銘琦，趙 敏，華 祥，等.慶大霉素C1a高產(chǎn)菌株的推理育種的研究[J]. 中國(guó)抗生素雜志，1998，23（6）:410.

[6]Anand MK，Satish AP.Impurity profile of active pharmaceutical ingredient:A review[EB/OL].(2006-09-24)[2010-09-24]http://www.pharmainfo.net/reviews/impurity-profile-active-pharmaceutical-ingredient-review.

[7]Li B,Adams E,Van Schepdael A,et al.Analysis of unknown compounds in gentamicin bulk samples with liquid chromatography coupled with ion trap mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2006,20(3):393-402.

[8]Li B,Van Schepdael A,Hoogmartens J,et al.Investigation of unknown related substances in commercial neomycin samples with liquid chromatography/ion trap tandem massspectrometry[J].RapidCommunMass Spectrom,2007,21(11):1791-8.

[9]Li B,Van Schepdael A,Hoogmartens J,et al.Characterization of impurities in sisomicin and netilmicin by liquid chromatography/mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2008,22(22):3455-71.

[10]盛龍生，蘇煥華，郭丹濱.色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[11]Vogel R,Defillipo K,Reif V.Determination of isepamicin sulfate and related compounds by high performance liquid chromatography using evaporative light scattering detection[J].J Pharm Biomed Anal,2001,24(3):405-12.

[12]袁耀佐，張 玫，錢 文，等.高效液相色譜-電噴霧-離子阱質(zhì)譜法推定硫酸依替米星中有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[J].分析化學(xué)，2010，38（6）:817-22.

[13]袁耀佐，譚 力，張 玫，等.HPLC-ESI-IT-MSn法快速推定硫酸小諾霉素中有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu) [J].藥學(xué)與臨床研究，2010，18（1）:31-7.

[14]鄭 衛(wèi)，魏天恩，程振泰，等.小單孢菌FIM-203產(chǎn)生慶大霉素 A 的研究[J]. 海峽藥學(xué)，2006，18（4）:170-3.

[15]黎 俊，付志綱，張 威，等.慶大霉素B的生產(chǎn)工藝:中國(guó)，200810070844[P].2008-08-27.

[16]倪雍富，朱堅(jiān)屏.氨基糖苷類抗生素M-41-A的分離和鑒別[J]. 中國(guó)抗生素雜志，2001，26（5）:337-9.