心理應激對大鼠氧化應激的影響及TLR4的作用

趙詠梅，王希柱，劉寶義

(1.開灤集團有限責任公司林西醫院，河北 唐山 063103；2.河北聯合大學附屬唐山人民醫院，河北 唐山 063000)

研究表明，心理應激時經神經內分泌機制釋放的應激激素能夠啟動或參與和炎癥反應相似的調節機制，促進細胞因子的釋放，引起血管壁的慢性炎癥反應，即心理性刺激觸發的應激反應實際上涵蓋了炎癥反應[1-2]，但其機制尚不明確。Toll樣受體(TLRs)是一種介導炎癥和天然免疫的跨膜信號轉導受體家族，其中TLR4與動脈粥樣硬化(AS)的發生發展及斑塊穩定性關系密切[3]。本研究擬通過慢性空瓶刺激建立大鼠心理應激模型，觀察各組大鼠氧化應激反應和主動脈TLR4表達并進行定量分析，初步探討心理應激對大鼠氧化應激的影響及TLR4所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及設備 兔抗大鼠TLR4多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔SP-9001免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TNF-α放免試劑盒購自解放軍總醫院科技開發中心放免所；高速冷凍離心機(法國Jouan公司)、0725型紫外光柵分光光度儀(山東高密分析儀器廠)、光學顯微鏡(Olympus，日本)，HH-4型數顯恒溫水浴箱(北京醫療設備廠)、DHG(102)型電熱干燥箱(山東濰坊醫療器械廠)、RM213轉輪石蠟切片機(德國Leica公司)。

1.2 實驗動物與飼養條件 健康雄性Wistar大鼠40只，體重180～200 g。由華北煤炭醫學院實驗動物中心提供。動物飼養于屏障系統環境下，室溫18℃～21℃、相對濕度45%～55%。

1.3 動物分組與處理 將40只大鼠隨機分為正常對照組(NC)、無應激組(NS)、生理應激組(PS)和心理應激組(ES)，每組各10只。ES組和PS組分別在不同的房間單籠喂養，NC組和NS組每籠5只。NS組、PS組和ES組給予高脂飲食+維生素D3負荷(一次性腹腔注射維生素D360萬IU/kg)，NC組給予普通飲食+生理鹽水(一次性腹腔注射等體積生理鹽水)。高脂飲食配方：3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%普通飼料。

1.4 應激模型的建立 參照邵楓等[4]的方法制作心理應激模型。所有動物經一周適應性飼養后，定時喂水訓練8周：每天僅在8:00～8:10和20:00～20:10給予定時飲水兩次，每次10 min，其余時間不予飲水。于第8周最后一次定時飲水期間開始給予心理應激和生理應激。具體方法是ES組大鼠在原定時喂水期間不喂水并給予無規律的空瓶刺激，每天0～2次不等，使之產生慢性情緒應激。PS組大鼠在此期間亦不喂水，但也不給予空瓶刺激，目的是對比觀察生理性缺水對實驗的影響。應激在連續的兩周內被給予14次，每次10 min。NS組和NC組大鼠繼續2次/d定時飲水。整個實驗周期為10周。

1.5 標本采集與觀察指標 于末次應激結束后立即用10%水合氯醛(30 mg/kg)行腹腔麻醉，腹主動脈取血、靜置、離心(3 000 rpm)、收集血清分裝，置于-20℃冰箱保存待檢。取血后取主動脈根部至主動脈弓處血管0.5 cm，4℃生理鹽水沖洗、4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續切片，用于HE染色及免疫組化測定TLR4表達(SP法)。黃嘌呤氧化酶法檢測過氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸(TBA)法檢測丙二醛(MDA)，放射免疫法測定血清腫瘤壞死因子(TNF-α)水平，操作程序嚴格按照試劑盒說明書進行。利用光鏡(400倍)觀察TLR4表達和分布情況，以血管內膜出現棕黃色者為陽性表達。每張切片隨機選取4個視野，采用Micro-Optic數碼醫學圖像分析系統分析陽性細胞單位面積平均光密度值(OD)，取平均值進行統計分析。

1.6 統計學方法 SPSS13.0統計軟件包進行統計分析。實驗數據以均數±標準差(±s)表示，多組間計量資料的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩組間比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。

2 結果

2.1 氧化應激 ES組大鼠血清SOD活力明顯低于其他三組而MDA含量明顯升高；NS組、PS組血清SOD活力低于NC組而MDA含量升高；PS組與NS組比較，血清SOD活力亦降低、MDA含量升高，見表1。

表1 各組大鼠血清SOD、MDA比較（±s）

表1 各組大鼠血清SOD、MDA比較（±s）

注：同NC組比較，●P<0.05；同NS組比較，★P<0.05；同PS組比較，▲P<0.05。

組別MDA(nmol/ml)SOD(U/ml)NC NS PS ES 5.58±0.22 6.31±0.18●6.56±0.22●★7.58±0.34●★▲222.31±13.61 200.71±12.91●187.22±10.28●★170.57±11.28●★▲

2.2 炎性相關因子 NC組、NS組、PS組和ES組的大鼠血清TNF-α分別為(1.772±0.0751)μg/L、(2.181±0.0847)μg/L、(2.189±0.0989)μg/L和(2.447±0.083)μg/L。ES組大鼠血清TNF-α水平明顯高于其他三組；NS組、PS組亦高于NC組；PS組與NS組比較差異無統計學意義。

2.3 主動脈HE染色 光鏡顯示ES組大鼠主動脈出現早期AS改變：血管內膜連續性中斷，內皮細胞不規則脫落，內彈力板薄厚不均勻，部分交織狀排列或呈波浪狀，并出現斷裂分離現象，平滑肌細胞增生且與中層彈力板之間排列紊亂。其余三組未見明顯形態學改變。

2.4 主動脈TLR4表達 免疫組化結果顯示TLR4在NC組幾乎無陽性表達，NS組、PS組、ES組均有表達，OD值分別為(0.037±0.005)、(0.238±0.015)、(0.250±0.012)和(0.334±0.010)，蘇木素復染顯示其主要表達于血管內膜。ES組表達強度明顯高于PS組和NS組；PS組與NS組表達強度比較差異無統計學意義。

3 討 論

本實驗所采用的慢性空瓶刺激是一種與憤怒或焦慮關系更為密切的慢性心理應激模型[4]。實驗結果顯示，ES組、PS組、NS組均出現了明顯的氧化應激反應(血清SOD活力下降而MDA含量上升)和炎癥反應(血清TNF-α升高)。而ES組較其他兩個處理組引起的導致血管內皮細胞損傷相關因素變化更為明顯：氧化應激損傷(血清SOD活力下降而MDA含量升高)、炎癥反應(血清TNF-α升高)。PS組較NS組氧化應激損傷更為明顯(血清SOD活力下降而MDA含量上升)，但兩組間炎癥反應(血清TNF-α)差異無統計學意義。主動脈HE染色顯示，ES組出現了早期AS改變，但并無動脈硬化斑塊等典型AS病理變化。

研究表明，氧化應激在AS發生發展中發揮重要作用[5]。過多的活性氧不僅直接損傷血管內皮細胞，還通過信號轉導系統引起炎癥反應效應物的相關基因核轉錄，增強血管局部炎癥反應。MDA反映體內活性氧水平，間接地體現氧化應激損傷的嚴重程度。SOD是一種抗氧化酶，發揮保護細胞免受氧化應激損傷的作用。本實驗結果顯示，心理應激可導致明顯的氧化應激損傷，與既往研究結果一致[6-7]。NS組、PS組大鼠氧化應激反應亦較NC組明顯，提示不僅是心理應激，生理應激和高脂飲食也能影響動物體內氧化和抗氧化過程的平衡，多種因素聯合作用可加重機體的氧化應激損傷，進而促進AS的發生和發展。

Ross[8]指出，AS是一種慢性炎癥性疾病。各種危險因素損傷血管內皮細胞，使之表達各種趨化因子和粘附分子，介導單核-巨噬細胞和淋巴細胞粘附、聚集于內膜損傷位點表面并移行增殖于內膜下。激活的內皮細胞與巨噬細胞釋放TNF-α、白細胞介素(IL)-1等多種炎性細胞因子，擴大炎癥反應的級聯效應。ES組、PS組、NS組血清TNF-α均較NC組升高，特別是ES組升高明顯，提示心理應激，生理應激和高脂飲食均能引起大鼠體內的炎癥反應，而心理應激的影響更為嚴重。

TLR4突出的生物學活性是促進機體內炎性細胞因子的合成和釋放，引發機體的炎癥反應[9]。其不僅在AS斑塊組織中表達強烈，慢性炎癥過程亦可上調大血管組織中TLR4表達[10]。我們的實驗結果顯示，在出現早期AS病理改變的ES組大鼠以及沒有出現明顯組織學改變、但伴有氧化應激損傷和炎癥反應的PS、NS組大鼠，主動脈TLR4表達均上調，提示TLR4參與了大血管早期炎性改變的發生。

Caso等[11]報道，TLR4可介導亞急性應激后腦組織的炎性反應。另有研究表明[12]，慢性應激可通過TLR4-NF-κB途徑引起TNF-α等炎性因子的釋放，導致心肌細胞損傷。我們通過對四組大鼠主動脈TLR4的表達強度進行統計學分析發現，ES組大鼠主動脈TLR4表達明顯增強，結合我們前面的討論，心理應激可導致與AS密切相關的氧化應激損傷和炎癥反應，提示TLR4可能部分介導了心理應激導致的AS發病過程。它可能在體內環境中的某些變化(如氧化應激導致體內慢性炎癥反應)和動脈形態學變化之間起橋梁作用。雖然心理應激引起AS炎癥反應可能存在多方面機制，但ES組主動脈TLR4表達上調也提示，心理應激可能至少部分是通過TLR4的激活導致血管局部的炎癥反應，而血管局部炎癥活動是AS形成過程中最主要的特征，動脈組織中出現炎癥因子表達增高可視為AS形成的一個早期信號。PS組主動脈TLR4表達較NS組無明顯差異，考慮可能與生理應激的強度或實驗動物數量偏少有關。

TLR4是細菌脂多糖的關鍵受體。Kieran等[13]研究發現，TLR4介導了脂多糖誘導的單核細胞活性氧的產生，而抗氧化劑能夠抑制脂多糖所誘導的細胞因子基因靶點活化，氧化應激可以通過轉錄調控因子調節TLR4的表達，提示氧化應激能夠影響TLR4介導的炎癥反應。也有研究認為低氧可通過內皮細胞線粒體產生活性氧增多而下調TLR4表達[14]。本實驗顯示，心理應激在導致機體氧化應激損傷和炎癥反應的同時，主動脈出現早期AS病理變化且TLR4表達增強，提示氧化應激有可能在AS形成的早期，通過激活TLR4釋放TNF-α等炎性因子促進血管壁的炎癥反應，進而促進AS形成。

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