高濃度葡萄糖對Notch2信號通路及破骨細胞分化的影響

段 莉，林典岳*

（1.海南醫學院附屬醫院口腔科，海南 海口 571101；2.海南醫學院口腔醫學院，海南 海口 571101）

破骨細胞來源于骨髓造血干細胞，由單個核前體細胞融合而成。已有研究提示，在破骨前體細胞向破骨細胞分化過程中，受到包括血糖濃度在內的多種微環境因素的調控[1]。同時，也有研究表明Notch信號是破骨細胞分化過程中重要信號通路之一[2-5]。目前，有關高糖濃度條件對破骨細胞分化及對Notch信號的影響還不清楚。因此，本研究旨在探討高糖條件下，破骨細胞的分化以及Notch信號通路相關基因的表達情況。

1 材料與方法

1.1 試劑 α-MEM、特級胎牛血清，磷酸萘酚AS-MX，固紅紫色LB磷酸鹽(Sigma，美國)；RANKL，M-CSF(Peprotech，美國)；TRIzol試劑(Invitrogen，美國)；SYBR GREEN 試劑盒(Takara，日本)。

1.2 細胞培養 選用4周齡SD雄性大鼠，斷頸處死，無菌條件下分離完整股骨、脛骨，暴露髓腔后用α-MEM培養基(含10%胎牛血清)沖洗骨髓腔數次至骨干發白為止。接種于10 cm培養皿，標準培養(飽和濕度、5%CO2、37℃)12 h 后收集非貼壁細胞，1 500 r/min，37℃離心5 min，棄上清，視為破骨前體細胞，加入M-CSF(20 ng/ml)和RANKL(30 ng/ml)誘導其向破骨細胞分化。

1.3 高濃度葡萄糖刺激 按照濃度依次增高的順序，設置0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L，40 mmol/L五個葡萄糖梯度，同時設置相對應的甘露醇濃度，作為等滲對照。

1.4 抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色 將細胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，4%福爾馬林固定液(Paraformal dehyde fixative)室溫固定10 min，PBS洗2次，甲醇(Methyl alcohol)和丙酮(Aceton)混合液(1:1)固定 3～5 min，PBS洗2次[TRAP染色液配方：N,N-二甲基甲酰胺(N-N-Dimethylformamide)500 μl，磷酸萘酚 AS-MX(Naphtol AS-MX phosphate)5 mg，TRAP緩沖液×50 ml；固紅紫色 LB 磷酸鹽(Fast red violet LB salt)30 mg]，37℃10 min，雙蒸水洗3次，光鏡觀察。多核(細胞核數目≥3個)且TRAP染色陽性的細胞視為破骨細胞。

1.5 RNA的提取、cDNA制備及實時定量PCR分析 用TRIzol試劑一步法抽提細胞總RNA，紫外分光光度儀測定RNA260/RNA280吸光度值以檢測RNA樣品的純度和濃度。按Fermentas逆轉錄試劑盒操作進行RT-PCR[在 20 μl反應體系中含 200 U MMLV 逆轉錄酶，1×MMLV 緩沖液，20 U RNase，0.5 μg Oligo d(T)，2.5 mmol/L dNTP，1μg 總RNA模板]。cDNA合成在42℃進行60 min，70℃滅活5 min。實時定量PCR分析用SYBR Green試劑盒。利用Primer Express 2.0設計針對 Notch1、Notch2、Jagged1基因與β-actin引物如下：小鼠Notch1正義鏈5'-TCAATGCCGTGGATGACCTA-3'，反 義 鏈 5'-CCTTGTTGGCTCCGTTCTTC-3'；小鼠Notch2正義5'-CCCCTTG CCCTCTATGTACCA-3'，反 義 鏈 5'-GGTAGGTGGGAAAGCCACACT-3'；小鼠Jagged1正義鏈5'-CG GTGGCTGGGAAGGAA-3'，Jagged1 反義鏈5'-CTCGGGCCACACCAGAC-3'；β-actin 正義鏈 5'-TGAGA GGGAAATCGTGCGT-3'，反義鏈5'-GCTGGAAGGT GGACAGTGAG-3'。 利 用 2-ΔΔCT公 式 計 算 Notch1、Notch2和Jagged1相對于β-actin的基因表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件包進行統計。各組數據采用均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，組間比較用SNK方法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高濃度葡萄糖抑制RANKL誘導的破骨細胞分化 TRAP染色定量分析破骨細胞分化情況，每組重復三次。圖1示多核且TRAP染色為陽性的破骨細胞。從圖2中可以看出，葡萄糖濃度達到10 mmol/L時與對照組差異無統計學意義，隨著葡萄糖濃度的繼續增高，破骨細胞數目減少，實驗組(20 mmol/L葡萄糖)破骨細胞個數為(110.3±6.81)，對照組(20 mmol/L甘露醇)破骨細胞個數為(152.7±7.0)；當葡萄糖濃度增高至40 mmol/L，實驗組破骨細胞個數為(72.0±8.0)，而對照組(40 mmol/L甘露醇)破骨細胞個數為(157±12.5)，實驗組與對照組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。該結果提示高糖環境可以抑制RANKL誘導的破骨細胞分化。

圖1 破骨細胞顯微鏡下觀

圖2 高糖條件下RANKL誘導破骨細胞的數量

2.2 高濃度葡萄糖抑制Notch2基因mRNA表達 實時定量PCR定量分析Notch1，Notch2和Jagged1表達情況，每組重復3次。葡萄糖濃度達到10 mmol/L時，Notch1、Notch2和Jagged1表達水平與對照組差異無統計學意義，隨著葡萄糖濃度的繼續增高，Notch1和jagged1的表達水平無明顯變化，但Notch2受體表達水平逐漸降低。實驗組(20 mmol/L葡萄糖)Notch1、Notch2和Jagged1的相對表達量分別為(1.25±0.43)，(1.65±0.23)和(1.16±0.38)，對照組(20 mmol/L甘露醇)Notch1、Notch2和Jagged1的相對表達量分別為(1.84±0.38)，(2.82±0.28)，和(1.52±0.26)；當葡萄糖濃度增高至40 mmol/L，實驗組Notch1、Notch2和Jagged1的相對表達量分別為(1.14±0.45)，(1.1±0.11)，(1.09±0.23)，對照組(40 mmol/L甘露醇)Notch1、Notch2和Jagged1的相對表達量分別為(1.66±0.40)，(2.42±0.27)，(1.45±0.34)。實驗組與對照組間Notch2的表達水平差異有統計學意義(P<0.05)(見圖3)。該結果提示高糖環境抑制RANKL誘導Notch2表達。

圖3 實時定量PCR分析高糖對RANKL誘導Notch1、Notch2和Jagged1表達的影響

3 討論

糖尿病和骨代謝疾病(如骨質疏松)是影響人類生活健康的兩大常見疾患，二者發病機制密切相關，骨骼亦是糖尿病慢性并發癥的受累器官之一[6-7]。眾多研究已證實，高血糖狀態引發骨質疏松主要是通過抑制成骨細胞的骨形成過程[8]。但是，有關高血糖狀態下骨代謝過程中另外一個主要功能細胞-破骨細胞的研究較少。

正常成人在生理狀態下，通過破骨細胞的骨質再吸收和成骨細胞精確協調，保持骨質的不斷更新。破骨前體細胞向破骨細胞分化及其骨吸收過程中，受到破骨細胞活化因子(如RANKL)及破骨細胞抑制因子系統(如OPG)的精密調控[9]，同時，也需要葡萄糖作為基本的能量代謝物質。人體內正常血糖濃度大約為5.5 mmol/L，因此本實驗選擇葡萄糖濃度為5.0 mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L，40 mmol/L的α-MEM培養基培養破骨前體細胞。從本研究結果可以看出，各組均有破骨細胞形成，隨著葡萄糖濃度的增高，多數實驗組破骨細胞的數量少于對照組，二者間差異有統計學意義。該研究結果與Wittrant等[1]的報道一致。本研究提示RANKL能誘導破骨前體細胞向破骨細胞分化，而高糖環境可以抑制破骨細胞分化，并且呈現出濃度依賴性，總體趨勢是濃度越大，抑制破骨細胞分化的能力越強。

基于Notch信號在生物進化中的保守性及其作用的廣泛性[10]，本研究欲初步探討高糖條件下破骨細胞分化過程中，Notch信號通路基因的相關變化情況。Notch基因最早發現于果蠅，該基因的部分功能缺失會在果蠅翅膀的邊緣造成缺口(Notch)，Notch基因由此而得名。脊椎動物中有4個Notch同源體：Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。Notch配體共有5種，分為兩個家族：Jagged 家族(Jagged1、Jagged2)和Delta-like家族(Delta1、Delta3和Delta4)。最新研究表明Notch2受體與配體Dll1結合后，正向調控破骨細胞分化過程；而Notch1受體與Jagged1配體結合負向調控破骨細胞分化過程[2]。本實驗研究主要檢測高糖條件下，RANKL誘導破骨前體細胞向破骨細胞分化過程中，細胞表面Notch1、Notch2、Jagged1的表達情況。研究結果表明RANKL促進破骨前體細胞Notch1、Notch2、Jagged1基因的mRNA表達水平，該研究結果與一些學者[3-5]報道一致。但隨著葡萄糖濃度的增高，實驗組Notch2的表達水平低于對照組，二者之間差異具有統計學意義。說明RANKL能提高細胞Notch2的表達水平，而高糖環境抑制Notch2的表達，提示Notch2信號可能參與調控高糖環境下RANKL誘導的破骨細胞分化過程。然而，在高糖條件下，有關Notch信號途徑中受體與配體具體相互作用方式與及其機制尚不明確。因此，針對高糖條件下Notch信號在破骨細胞分化過程中的作用需進一步研究探討。

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