天冬總皂苷對D-半乳糖致衰老大鼠腎臟p53基因表達(dá)的影響

李艷菊 李琴山 田 碩 劉 洋 (貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科，貴州 貴陽 550004)

隨著我國老年人群的比重逐年增加，老年人群慢性腎功能減退的比率明顯升高。這不僅能夠?qū)е陆K末期腎臟疾病，而且能夠增加老年人心血管病的發(fā)病概率，腎臟衰老正逐漸成為影響我們國民健康和社會發(fā)展的主要疾病。中藥天冬(Riadix asparag)為百合科植物天門冬〔Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.〕的干燥塊根〔1〕。其主要成分為天冬總皂苷〔2〕，研究證明天冬具有抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性〔3～6〕，但對于天冬總皂苷治療腎臟衰老的作用及其機制未見報道，本實驗通過皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型，研究天冬總皂苷治療衰老大鼠腎臟的效應(yīng)及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 選用清潔級雄性SD大鼠(購自第三軍醫(yī)醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物編號:2007-0005)，8～9周齡，體重160～180 g。

1.2 材料 天冬總皂苷購于上海尚誼化工科技有限公司(純度為98%);D-半乳糖 (Sigma產(chǎn)品);Trizol試劑、RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司);引物序列由primer 3設(shè)計，上海英俊公司合成;倒置相差熒光顯微鏡(德國Lica公司);全自動生化分析儀(德國Lica公司)。

1.3 衰老模型的制備及給藥 實驗分5組，每組隨機分配10只雄性大鼠，比較各組大鼠間的體重差異，無統(tǒng)計學(xué)意義;①正常組:每日皮下注射生理鹽水0.5 ml，連續(xù)注射3個月;②模型組:每日皮下注射 D-半乳糖 400 mg/kg，連續(xù)注射 3 個月〔7，8〕;③天冬總皂苷低劑量組(Asp1):每日皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型的同時，將3 g/kg天冬總皂苷灌胃治療3個月;④天冬總皂苷中劑量組(Asp2):每日皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型的同時，將6 g/kg天冬總皂苷灌胃治療3個月;⑤天冬總皂苷高劑量組(Asp3):每日皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型的同時，將12 g/kg天冬總皂苷灌胃3個月。

1.4 血清中肌酐(Cr)及尿素(UREA)的檢測 治療結(jié)束后，腹腔注射氯胺酮對大鼠進(jìn)行麻醉，心臟取血，3 000 r/min離心15 min提取大鼠血清，應(yīng)用全自動分析儀檢測血清中Cr及UREA的含量變化。

1.5 腎臟組織光鏡定量分析 取一側(cè)腎組織塊放入10%Formalin固定，常規(guī)石蠟包埋，切片5 μm厚，HE染色，于顯微鏡下觀察并計算各組腎小球硬化程度改變。

1.6 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)表達(dá)的測定

治療結(jié)束后對大鼠進(jìn)行麻醉，心臟取血，3 000 r/min離心15 min提取大鼠血清，按照試劑盒說明書測定各組血清中和各個組織中SOD和MDA的水平。

1.7 實時PCR測定腎臟組織p53 mRNA表達(dá) 大鼠腎臟總RNA采用Trizol法提取，采用實時定量-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行基因片段擴增并定量。PCR反應(yīng)各管所加模板RNA的量約為1 μg。最終通過Real-time PCR儀記錄的Ct值而對起始模板相對定量。

2 結(jié)果

2.1 尿素、肌酐的檢測 正常組與模型組，模型組與治療組，組間比較差異顯著(P＜0.05)，而且隨著天冬總皂苷劑量的增加，其降低UREA及Cr作用增強。見表1。

表1 天冬總皂苷對血清中Cr和UREA水平的影響(±s，n=10)

表1 天冬總皂苷對血清中Cr和UREA水平的影響(±s，n=10)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;3)P＜0.01，下表同

組別 UREA(mmol/ml) Cr(μmol/ml)正常組3.12±0.28 82.15±6.18模型組 7.14±0.651) 112.51±8.161)ASP1 6.09±0.422) 105.95±10.592)ASP2 4.78±0.363) 95.45±6.482)ASP3 4.02±0.213) 88.75±6.853)

2.2 腎臟組織的光鏡分析結(jié)果 100倍光鏡下，正常組無硬化腎小球存在，而模型組硬化的腎小球顯著增加，治療組隨用藥濃度的增加，其硬化率有降低趨勢。見表2。

2.3 SOD和MDA表達(dá)的測定 治療組大鼠血清中和腎臟組織中SOD活性明顯高于模型組，MDA含量明顯低于模型組，并呈劑量依賴性(P＜0.05)。表3，表4。

2.4 Real-time PCR測定腎臟組織p53 mRNA表達(dá) 模型組p53 mRNA的表達(dá)高于正常組〔(203.66±11.63)vs(72.38±5.17)，P ＜0.05〕，ASP1、ASP2、ASP3 組隨著藥物濃度的提高，p53 mRNA表達(dá)降低，有劑量依賴性〔(160.27±10.48)、(144.48±11.54)、(96.35±6.78)，P ＜0.05〕。

表2 光鏡下腎小體及硬化腎小體計數(shù)(x ±s，個/視野，n=10)

表3 天冬總皂苷對大鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

表3 天冬總皂苷對大鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01

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表4 天冬總皂苷對大鼠腎臟中SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

表4 天冬總皂苷對大鼠腎臟中SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

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3 討論

腎臟是功能減退最快的重要器官之一，也是受衰老影響最明顯的器官之一。D-半乳糖引起的代謝紊亂使機體過氧化反應(yīng)增強是其致腎臟衰老反應(yīng)的重要因素〔6〕。D-半乳糖在體內(nèi)氧化產(chǎn)生的大量自由基超過機體的清除能力，引發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物MDA，加重對細(xì)胞的損傷，并伴隨著抗氧化酶SOD的減少，所以本實驗采取D-半乳糖致腎臟衰老模型〔7，8〕，并發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，天冬總皂苷治療組能夠提高血清與腎臟中SOD的活性、降低MDA含量，具有劑量依賴性，說明天冬總皂苷可能通過氧自由基途徑具有治療腎臟衰老的作用。

腎臟的形態(tài)學(xué)老化改變表現(xiàn)為腎小球硬化性改變，會出現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜容積相對增大，腎小球入球血管硬化，毛細(xì)血管叢較少，基膜增厚，這些改變導(dǎo)致腎小球濾過面積減少，本實驗發(fā)現(xiàn)天冬總皂苷治療組能夠降低腎小球硬化率，而且有劑量依賴趨勢。

Cr是小分子物質(zhì)，可通過腎小球濾過，在腎小管內(nèi)很少吸收，每日體內(nèi)產(chǎn)生的Cr，幾乎全部隨尿排出，一般不受尿量影響。腎功能不全時，Cr在體內(nèi)蓄積成為對人體有害的毒素。血Cr測定是診斷腎臟衰竭的重要指標(biāo)，與腎功能的損傷程度呈正相關(guān)。UREA為人體蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物，主要由腎臟排泄，UREA含量的高低取決于機體的蛋白質(zhì)的分解代謝與腎臟的排泄功能。在一般活動和比較穩(wěn)定的情況下，血尿素和腎小球濾過功能成反比關(guān)系，UREA增高多提示腎小球濾過功能減退。本實驗說明模型組大鼠存在腎功能的減退，治療組能夠改善衰老大鼠的腎功能，并且治療組降低Cr及UREA的作用具有劑量依賴趨勢。

衰老與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，目前認(rèn)為衰老是一種與基因相關(guān)的疾病，在衰老細(xì)胞中起重要作用的是p53抑癌基因。p53基因是重要的細(xì)胞周期、凋亡調(diào)節(jié)基因，活化的p53可以影響許多基因的表達(dá)，因此p53基因被認(rèn)為是影響人類壽命的一個關(guān)鍵基因〔9～12〕。本實驗發(fā)現(xiàn)與模型組相比，天冬總皂苷治療組能夠降低腎臟組織p53基因表達(dá)，因此推測天冬總皂苷降低p53基因的表達(dá)可能是其改善衰老大鼠腎臟的機制之一，進(jìn)而本實驗為天冬總皂苷的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典〔S〕.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:37.

2 Nishritha B，Sanjay S.Asparagus racemosus-Ethnopharmacological evaluation and conservation needs〔J〕.J Ethnopharmacol，2007;110(1):1-15.

3 Cornwell T，Cohick W，Raskin I.Review:dietary phytoestrogens and health〔J〕.Phytochemistry，2004;65(8):995-1016.

4 Parihar MS，Hemnani T.Experimental excitotoxicity provokes oxidetive damage in mice brain and attenuation by extract of Asparagus racemosus〔J〕.J Neural Transm，2004;111(1):1-12.

5 Bhattacharya A，Murugandam AV，Kumar V，et al.Effect of polyherbal formulation，EuMil，on neurochemical perturbations induced by chronic stress〔J〕.Indian J Exp Biol，2002;40(10):1161-3.

6 Dahanukar SA，Kulkarni RA，Rege NN，et al.Pharmacology of medicinal plants and natural products〔J〕.Indian J Chem，2003;32(3):81.

7 李艷菊，胡亮杉，郭坤元.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞回輸對大鼠腎臟衰老的影響〔J〕.中華腎臟病雜志，2009;25(3):241-2.

8 李艷菊，鄧 蘭，黃 睿.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠腎臟衰老的影響〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2009;48(6):458-61.

9 Ander Matheu，Antonio Maraver，Manuel Serrano.The Arf/p53 pathway in cancer and aging〔J〕.Cancer Res，2008;68(15):6031-4.

10 Lawrence A，Donehower A.Using mice to examine p53 functions in cancer，aging，and longevity〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009;1(6):a001081.

11 Zhaohui Feng，Meihua Lin，Rui Wu.The Regulation of aging and longevity:a new and complex role of p53〔J〕.Genes Cancer，2011;2(4):443-52.

12 Zhaohui Feng，Wenwei Hu，Angelika K，et al.Declining p53 function in the aging process:a possible mechanism for the increased tumor incidence in older populations〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(42):16633-8.