α7尼古丁受體mRNA表達抑制對SH－SY5Y細胞氧化應激水平的影響

歐陽凱 齊曉嵐 官志忠 (貴陽醫學院分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

在阿爾茨海默病(AD)患者大腦皮層腦組織中神經型尼古丁受體的表達水平降低，膽堿能神經的功能缺陷在AD發病機制中具有重要的作用。氧化應激是指自由基產生過多或抗氧化物質水平減少而使兩者之間的平衡失調所造成的損傷，在多種中樞神經系統疾病的發生過程中起著重要作用。大量研究表明，AD是由多種因素共同作用引起的，自由基誘導的細胞損傷是AD的主要發病機制之一〔1〕。RNA干擾 (RNAi)是通過具有一定結構特點的，長約19～25 bp的小干擾 RNA(siRNA)，導人哺乳動物細胞后，能高效、特異的阻斷體內特定基因的表達，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型的過程〔2〕。本研究用體外合成的 siRNA抑制SH－SY5Y細胞 α7 nAChR的表達，研究其受抑制后對細胞氧化應激水平的影響，從而探討α7 nAChR對AD的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 源于人腦的 SH－SY5Y細胞由本課題組保存;DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶購于HyClone公司;鼠抗α7多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠抗兔二抗、α7 nAChR siRNA、siRNA熒光質控、siRNA 轉染試劑、siRNA轉染培養基均購于Santa Cruz公司;Oligo dT、dNTP購于上海生工公司;Trizol試劑購于Invitrogen公司;M－MLV逆轉錄酶購于Promega公司;RNA酶抑制劑購于Toyobo公司;TaqMan Universal 2 ×PCR Mix、α7 nAChR 和內對照 β－actin Taq－man 探針均購于 Applied Biosystems公司;鼠抗 β－肌動蛋白(β－actin)、Aβ1～42購于Sigma公司;聚乙烯二氟 (PVDF)膜、ECL－Plus發光試劑、高效顯影膠片購于Amersham公司;顯影液、定影液購于柯達公司;脂質過氧化產物、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－PX)測定試劑盒購于南京建成公司;細胞裂解液購于碧云天公司;普通化學試劑均購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SH－SY5Y細胞常規培養，培養基為DMEM，加入15%胎牛血清、1%雙抗(青霉素 100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)。培養箱中含5%CO2，溫度為37℃。

1.2.2 siRNA的轉染 生長良好的細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳入六孔細胞培養板中，待其匯合度達80%時按siRNA轉染說明書按不同比例進行轉染siRNA熒光質控，根據熒光值摸索和優化siRNA的轉染條件。分別轉染陰性對照 siRNA、α7 nAChR siRNA，轉染后6 h換正常培養基繼續培養48 h后收集培養基和細胞，設空白對照，每一轉染設3復孔，重復3次。

1.2.3 α7 nAChR沉默效率檢測 采用 Trizol一步法提取細胞總RNA。將mRNA逆轉錄反應成cDNA。以逆轉錄產物為模板進行 Real－time PCR。所用試劑為 TaqMan Universal 2×PCR Mix，α7 nAChR(Hs01063372_m1) 和 內 對 照 β－actin(Hs01060665_g1)Taqman探針購自Applied Biosystems公司，ABI Step One plus型熒光定量PCR儀采集待測基因及內參照β－actin擴增各循環熒光信號，以Applied Biosystems SDS1.4軟件進行熒光采集和數據分析。SDS1.4軟件分析其△△Ct值及RQ 值，RQ=2－△△Ct。分析實驗結果時以 β－actin為內對照，計算α7 nAChR mRNA和對照組的相對水平。

收集細胞，提取細胞蛋白并定量，用 Western印跡方法檢測α7 nAChR的蛋白表達水平。以 β－actin作為內對照。以Labworks軟件分析結果時以β－actin蛋白條帶作為內參照，計算α7 nAChR蛋白條帶與 β－actin蛋白條帶像素灰度的百分比值。

1.2.4 細胞分組及Aβ1～42處理 細胞轉染48 h后換無血清無雙抗的DMEM培養基1 ml 12 h，加入Aβ1～42使其終濃度為1 μmol/L，按以下分組:空白對照組、陰性對照組、轉染 α7 nAChR siRNA 組、空白對照 +Aβ1～42組、陰性對照 +Aβ1～42組、轉染 α7 nAChR siRNA+Aβ1～42組。

1.2.5 脂質過氧化水平測定 收集培養基，按測試盒說明書操作。采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定丙二醛(MDA)含量，氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化作用，并因此產生MDA，MDA可與TBA縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰。

1.2.6 SOD和GSH－PX活性測定 收集細胞，超聲裂解提取蛋白并定量，按測試盒說明書操作。SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，GSH－PX活性采用比色定量法。

2 結果

2.1 轉染α7 nAChR siRNA后 α7 nAChR mRNA水平和蛋白表達水平 轉染針對α7 nAChR基因的siRNA后SH－SY5Y細胞α7 nAChR mRNA水平和蛋白表達水平分別下降了81.7%和76.9%(表1)，轉染陰性對照與對照組相比無差異。說明已將 α7 nAChR siRNA轉入人 SH－SY5Y細胞，且抑制了 α7 nAChR mRNA和蛋白水平的表達，瞬時轉染α7 nAChR基因沉默細胞構建成功。

2.2 脂質過氧化水平 轉染針對α7 nAChR基因的siRNA及用1 μmol/L Aβ1～42處理 SH－SY5Y 細胞均能使細胞脂質過氧化水平升高，且α7 nAChR基因沉默后能增強Aβ神經毒性作用。見表2。

2.3 SOD活性和GSH－PX活性 轉染針對α7 nAChR基因的siRNA 及用 1 μmol/L Aβ1－42處理 SH－SY5Y 細胞均能使細胞SOD活性和GSH－PX活性降低，且α7 nAChR基因沉默后能增強Aβ的神經毒性作用。見表2。

表1 轉染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR mRNA及蛋白表達水平(±s，n=3)

表1 轉染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR mRNA及蛋白表達水平(±s，n=3)

與對照組比較:1)P＜0.01

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表2 轉染α7 nAChR siRNA后細胞MDA水平及SOD，GSH-PX活性(±s，n=3)

表2 轉染α7 nAChR siRNA后細胞MDA水平及SOD，GSH-PX活性(±s，n=3)

與對照組比較:1)P＜0.01，與對照+Aβ組比較:2)P＜0.01

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3 討論

RNA干擾(RNAi)能特異性抑制基因表達，是一種轉錄后基因沉默機制(PTGS)。RNAi通過小的dsRNA高效、特異的阻斷體內特定基因的表達，促使其mRNA特異性降解，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型的過程，具有高特異性、高穩定性、高效率性、高穿透性等特性〔2〕。目前RNAi技術已廣泛用于功能基因組學、基因治療學、新的藥物開發等眾多領域。

尼古丁乙酰膽堿受體是一類明確的具有神經保護功能的受體，其減少與AD的發生有關。AD患者腦中膽堿能系統嚴重受損，腦組織中多個區域中尼古丁受體水平降低，AD患者大腦尼古丁受體密度降低。在活體組織和尸檢組織中也發現尼古丁受體水平的下降。在 APPSWE大鼠標本中可見 α7 nAChR的選擇性升高，提示α7 nAChR的升高是對Aβ毒性作用的一種保護機制。但α7 nAChR保護作用的機制并不清楚，因此本研究用體外合成的 siRNA抑制 SH－SY5Y細胞 α7 nAChR的表達，并研究其表達受抑制后細胞脂質過氧化產物、SOD和GSH－PX活性的變化，以進一步研究 α7 nAChR神經保護作用機制。

AD的主要病理變化有SPs、NFT及神經元死亡等。氧化應激與AD的這三個主要病理變化都相關〔3〕。氧化應激在多種中樞神經系統疾病的發生過程中起著重要作用。在自由基產生過多或抗氧化平衡被破壞時可通過攻擊細胞膜性脂質、蛋白質及DNA而造成細胞損傷。大腦細胞由于其細胞膜含有大量的對自由基的攻擊較敏感的多不飽和脂肪酸，因而容易受到自由基的損傷，產生大量的脂質過氧化產物。已發現AD病人腦組織中神經元胞漿、胞核及神經膠質細胞中蛋白氧化產物－蛋白羰基水平升高〔4〕。另外，在AD病人的尸檢報告中指出:在NFT形成部位存在蛋白羰基和脂質過氧化物水平升高〔5〕。在Aβ過度表達的轉基因動物中發現了與AD病人類同的氧化損傷表現，并且損傷程度與Aβ的沉積呈明顯正相關〔6〕。在對臨床AD病人的診斷研究中也發現，AD病人腦脊液中氧化應激標志物，如8－羥基－2－脫氧鳥苷酸等含量均升高〔7〕。有研究表明，氧化應激是AD發生的早期表現，是發生于SPs和NFT的上游病理事件〔8〕，與其他AD發生的可能機制相比，氧化應激在AD的發病機制中可能更為重要。

SOD可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞的傷害。GSH－PX是機體內廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，它特異地催化GSH對H2O2的還原反應，從而保護細胞膜結構和功能不受過氧化物的干擾及損害。測定這些指標可反映機體內源性抗氧化能力。本研究表明siRNA有效地抑制了α7 nAChR的表達，轉染后細胞脂質過氧化產物 (MDA)水平升高、SOD和GSH－PX活性降低明顯，氧化應激增強。用Aβ1～42處理細胞后發現氧化應激水平升高，說明Aβ可通過誘導氧化應激引起細胞損傷;且轉染針對α7 nAChR基因的siRNA后能夠增強Aβ的神經毒性作用。說明α7 nAChR能對抗細胞氧化應激從而發揮神經保護作用。

1 Qi XL，Xiu J，Shan KR，et al.Oxidative stress induced by beta－amyloid peptide is involved in the altered composition of cellular membrane lipids and the decreased expression of nicotinic receptors in human SH－SY5Y neuroblastoma cells〔J〕.Neurochem Int，2005;46(8):613－21.

2 Aigner A.Gene silencing through RNA interference(RNAi)in vivo:Strategies based on the direct application of siRNAs〔J〕.J Biotechno，2006;124(1):12－25.

3 Resende R，Moreira PI，Proenca T，et al.Brain oxidative stress in a triple transgemic mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.Free Radic Biol Med，2008;44(12):2051－7.

4 Moreira PI，Santos MS，Oliveira CR，et al.Alzheimer disease and the role of free radicals in the pathogenesis of the disease〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targets，2008;7(1):3－10.

5 Polidori MC.Oxidative stress and risk factors for Alzheimer′s disease:clues to prevention and therapy〔J〕.J Alzheimer Dis，2004;6(2):185－91.

6 Mao P，Reddy PH.Aging and amyloid beta－induced oxidative DNA damage and mitochondrial dysfunction in Alzheimer′s disease:implications for early intervention and therapeutics〔J〕.Biochim Biophys Acta，2011;1812(11):1359－70.

7 Ghidoni R，Benussi L，Paterlini A，et al.Cerebrospinal fluid biomarkers for Alzheimer′s disease:the present and the future〔J〕.Neurodegener Dis，2011;8(6):413－20.

8 Maruszak A，Zekanowski C.Mitochondrial dysfunction and Alzheimer′s disease〔J〕.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2011;35(2):320－30.